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新分离的吉氏芽孢杆菌S-2可利用糖甜菜浆生产碱性果胶酶

NewlyisolatedBacillusgibsoniiS-2capableofusingsugarbeetpulpforalkalinepectinaseproduction

ZumingLi1,2,ZhihuiBai1,3,BaoguoZhang1,HuijunXie1,QingHu1,ChunboHao1,WentongXue2andHongxunZhang1,*

1、ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,100085,Beijing,China

2、CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,100083,Beijing,China

3、SchoolofNaturalandBuiltEnvironments,UniversityofSouthAustralia,5095,MawsonLakes,SA,Australia

*Authorforcorrespondence:

Tel.:

+86-10-6284-9155,Fax:

+86-10-6292-3563,

E-mail:

hxzhang@

Received21March2005;accepted4May2005

摘要：

从碱性土壤样本中，可以分离出来一株可以生长在高碱性环境下的枯草芽孢杆菌。

该菌株为革兰氏阳性菌，好氧型细菌，嗜碱性细菌，本种细菌被指定为新分离的吉氏芽孢杆菌S-2。

生长过程中，观察本菌种的PH值变化范围为7–12，而温度变化范围为4–40°C。

对此种菌种进行序列分析显示本菌种的16SrDNA的出现几率超过了99%的同源性的吉氏芽孢杆菌。

S-2菌株之所以可以被确认为吉氏芽孢杆菌菌株是与吉氏芽孢杆菌DSM8722菌株的生理性质和生化性质做了一定的比较。

S-2菌株可以使用甜菜浆作为碳源以及通过果胶酶诱导产生细胞外的碱性果胶酶的固态发酵。

最大的多聚半乳糖醛酸酶产量为3600单位/克干甜菜浆是在35°C下发酵48小时时得到的。

关键词：

碱性果胶酶；吉氏芽孢杆菌；表型特征；16srDNA；固态发酵

简介：

嗜碱芽孢杆菌菌株是相当重要的生物技术的应用，特别是他们是从许多有用的酶类中提取出来的（赫瑞克史（1999）；葛丕铎等人（2002）；郝内多等人（2002）；尼尔森等人（1995））。

在根据系统发育和表型特征对嗜碱性枯草芽孢杆菌分类的改正做出了相当大的贡献。

有9个新的嗜碱性枯草芽孢杆菌的种类被推荐了，包括：

克劳氏芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、超嗜热性棵草芽孢杆菌、pseudoalkaliphilus芽孢杆菌、pseudofirmus芽孢杆菌、agaradhaerens芽孢杆菌、克氏芽孢杆菌、Halmapalus芽孢杆菌和碱芽孢杆菌，除此之外，还有先前已知种类，有：

嗜碱芽孢杆菌和科氏芽孢杆菌。

多年来碱性果胶酶一直被用于许多工业和生物技术的进程，例如：

纺织植物纤维加工，咖啡和茶发酵，石油开采，处理工业废水中含有的顽固性材料，净化植物病毒，造纸（卡什等人（2001）hoondal等人（2002））。

各种微生物已用于碱性果胶酶生产，并且它们中的许多都是嗜碱芽孢杆菌。

（辛格等人（1999）；卡什等人（2003）；小林等人（2003））。

我们都知道，没有一篇论文是因为吉氏菌种生产果胶酶的问题上被发表的。

为了减少酶的生产的成本，可以通过使用固态发酵或者使用低成本培养基来实现。

在本文中，我们报告了一个新确定的孤立的吉氏芽孢杆菌S-2以及通过固态发酵这株菌株来用糖甜菜浆进行碱性果胶酶的生产。

材料与方法

1、菌株分离

将从碱性土壤中分离出来的样品稀释在无菌0.9%NaCl溶液，然后镀上果胶琼脂板包括1.0%果胶（Sigma）,0.5%蛋白胨，0.5%酵母，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.6%NaCO3（NaCO3分别地消毒）。

将接种板在30摄氏度下培养3~7天从而获得菌体生长的。

用1%溴化十六烷基三甲铵将培养板着色。

透明圈菌落由果胶水解进行评估作为碱性果胶酶生产。

依据透明圈直径和菌落空隙挑选出来S-2作为一个好的碱性果胶酶生产者并用于进一步研究。

这株菌种递交给中国普通微生物菌种保藏中心编号为CGMCC1215.

2、表型的描述

用表型测试执行使用Dong&Cai（2001）的描述的方法，中调整到大约pH9.0–10.5通过添加10%碳酸钠。

所有的表型分析为菌株S-2被重复执行了两次。

3、DNA提取和扩增

提取S-2菌株染色体DNA用先前公布的提取方法（周等人。

1996）来提取。

细菌16SrRNA的基因编码从S-2菌株基因组的DNA通过引子对27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,M=C:

A）和1492r（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT,Y=C:

T）中被放大。

这些是标准引物适用于大多数真细菌，产品代表（>97%16SrDNA序列（大肠杆菌标准）（Kellner2002）PCR循环通过AppliedBiosystemGeneAmpPCRsystem2700被执行。

PCR放大反应条件是前面所述的（Sambrook&Russell2001）

4、DNA序列和核苷酸增加数量

培养基用于液体接种液培养包含（%w/v）:

蛋白胨1.5，酵母膏0.3，葡萄糖0.2，氯化钠0.2，K2HPO40.12，碳酸钠0.3。

培养基用高压灭菌法115摄氏度下持续灭菌15分钟。

将培养基（60ml）在250-ml锥形烧瓶中进行接种，然后培养在35摄氏度，震动150rev/min，持续24小时。

5、碱性果胶酶生产的固态发酵条件

用于果胶酶生产的培养基用10克干的甜菜浆来充当碳源，和生产果胶酶的诱导物（白等人（2004）），再加入30ml液体培养基（包括：

KH2PO40.15%，酵母提取物1.0%，Na2CO30.6%）组合培养基在500ml锥形瓶中115°C灭菌15分钟。

已经灭菌的培养基用于接种3ml的已经培养了24小时的菌种培养基，不同的培养温度选择范围在25-40°C。

酶的提取液加入100mlNa2CO3/NaHCO3的缓冲溶液（0.05,10.5）放置30分钟，加入离心机中以转速为9000转/分钟的速度，离心20分钟，移除小细胞单位和部分碎屑，上清液被指定为粗酶。

6、果胶酶的检验：

活性多聚半乳糖醛酸酶（PG：

一个重要的果胶酶品种）用3,5—二硝基水杨酸的方法和产生D—半乳糖醛酸水合物（司格马）作为标准来检测通过测量菌种群体减少的Napolygalacturonate（司格马）。

一单元的PG活性被定义为每55分钟释放1µmol半乳糖醛酸在温度为55°C下和PH值为10.5所消耗的酶的总量。

果胶裂解酶（PL，一个重要的果胶酶品种）的相关性质是用分光光度仪测量其在235纳米下所增加的吸光度来描述的（马丁斯等人（2002））。

每单位的活性PL被定义为：

每55分钟释放1µml的不饱和糖醛化合物在温度为55°C和PH为10.5的情况下消耗酶的总量。

该反应的底物为Napolygalacturonate（司格马）。

结果与讨论：

形态学和生理学的特点：

个体S-2的分类特点被总结在表格1中。

S-2是一种革兰氏阳性菌，严格的需氧型，孢子形态的杆状芽孢杆菌（0.4-0.6×2.0-4.3µm）。

该细胞可以生长在PH水平在7—12之间，在Na的浓度为2-12%的水平上PH值为9.0。

该细胞可以生长在温度为4-40°C，最佳生长温度为35°C。

在温度为45°C下没有菌体可以生长。

对个体S-2和参照菌体B.gibsoniiDSM8722（尼尔森等人1995）的表型特征进行研究发现性质相似。

（表格1）。

当菌体生长在40°C和水解值为中间的20时，才会观察到偏差。

他们同样在碳水化合物的利用方面表现出了极其相似的性质。

他们都可以用甘油，D-阿拉伯糖，木糖，半乳糖，l-arabinase，葡萄糖，甘露糖，果糖，鼠李糖，甘露醇，纤维二糖，麦芽糖，乳糖和蔗糖，棉子糖。

他们无法使用肌醇，山梨醇，a-甲基-D-葡萄糖苷，淀粉和葡糖酸盐。

只有山梨糖可以被个体S-2使用，但不能被B.GibsoniiDSM8722使用。

表一：

个体S-2表型特性和参考菌株吉氏芽孢杆菌DSM8722

16SrDNA序列分析和系统：

为了进一步性质描述，我们确定了一菌株的几乎完整的16SrDNA序列（1516个核苷酸）。

此序列已在GenBank中注册与登录号AY737309。

根据BLASTN的GenBank序列同源性分析，该序列是得分最高的被发现的芽孢杆菌物种。

在它们四株枯草芽孢杆菌之中，最高的一致性几乎超过99%。

该果胶酶序列是从B.gibsoniialkaliphilicB.gibsoniiDSM8722,B.gibsoniiT32,B.gibsoniiP203,B.gibsoniiSAFN-015显示99.5%,99.2%,99.4%和99.9%分别地同源和个体S-2。

为了了解菌株S-2系统的位置，我们构造了一个系统树基于16SrRNA序列的比较和芽孢杆菌菌株的参考（图形1）。

这些结果证明个体S-2是一个B.Gibsonii的菌株。

图形1：

统发育树基于16SrDNA序列分析显示B.gibsoniiS-2在alkaliphilicBacillus菌种成员的位置。

自举值（百分比表示的100的复制）被展示在分支点。

杆表明对应的距离5核苷酸每100个核苷酸。

碱性果胶酶生产

果胶酶包含催化果胶分解的异构酶。

主要果胶酶类型包括PG（EC3.2.1.15andEC3.2.1.67）,果胶酸酯裂解酶（EC4.2.2.10）,PL（EC4.2.2.2）,果胶酯酶（EC3.1.1.11）。

（http:

//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/）。

据初步试验，B.gibsoniiS-2主要生产PG和PL。

果胶酯酶未分析。

在不同的分温度下，B.gibsoniiS-2生产碱性PG的时间进程显示在图形2中。

PG的最大产量3600U/g干燥甜菜浆被获得在35摄氏度48小时后。

在不同的温度下，PL生产的时间进程显示在图形3中。

Hoondal等人.（2002）讨论了碱性果胶酶的微生物来源，他们的性能和应用。

研究结果被发表，B.gibsoniiS-2能被考虑作为一个有效率的碱性果胶酶的制造者。

图形3：

在不同温度下，B.gibsoniiS-2碱性PG生产的时间进程。

在25摄氏度（●）在30摄氏度（□）在35摄氏度（▲）在40摄氏度（○）

图形4：

在不同温度下，B.gibsoniiS-2碱性PL生产的时间进程。

在25摄氏度（●）在30摄氏度（□）在35摄氏度（▲）在40摄氏度（○）

结论

目前的研究表明，碱性土中的S-2是一个新的能生长在高碱的条下（pH12）的B.Gibsonii的菌株。

糖甜菜浆可作为碳源和果胶酶诱导通过S-2为了果胶酶生产用固态发酵的方式。

鸣谢

这项工作是由中国“863”计划支持（2001AA246014）。

我们感谢DrRichardHaas他的建议和DrHaifengLuo核酸序列分析援助和系统发生树的构建。

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