引物设计原则.docx

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引物设计原则

引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

（1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。

太长则比较浪费,且难以合成。

（2）引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T）.

（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。

（5）在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。

（6）两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。

两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

（7）引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。

所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。

（9）简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性。

否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。

引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。

利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：

Xmol/L＝OD260/A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）

X:

引物摩尔浓度,A、C、G、T:

引物中4种不同碱基个数。

分子生物学实验作的并不多，我的几点经验，

1直接查文献照搬别人成功的引物最省事。

2需要多对引物时，最好退火温度设计为同一温度，便于实验同时进行。

3RT-PCR及RealtimePCR的引物必须包含intron，以排除genomicDNA的影响

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。

　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

　　6.碱基要随机分布。

　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：

加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

　　11.引物应具有特异性。

　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。

在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：

　　1）避免重复碱基，尤其是G.

　　2）Tm=58-60度。

　　3）GC=30-80%.

　　4）3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

　　5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

　　6）PCR扩增产物长度：

引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

　　7）引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列

因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。

首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。

随后利用这一序列使用BLASTp（通过蛋白查蛋白），在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

二、对所找到的序列进行多序列比对

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有ClustalW，也可在线分析[url][/url]http:

//www.ebi.ac.uk/clustalw/。

三、确定合适的保守区域

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。

总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。

最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。

四、利用软件设计引物

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

五、对引物的修饰

若得到的引物为：

5-NAGSGNGCDTTANCABK-3

则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。

我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。

最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

如果知道了基因序列，（从pubmed上下载的）怎么样设计出最合适的引物呢？

关于引物设计，有oligo和primer5两种主要的软件，但是这两个软件***版的在网上很难找，我这里有primer5的***版.

    还有一种简便易行的因无设计方法，那就是利用在线的因无设计软件primer3.0进行引物的设计

1.打开网址:

http:

//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

2.在框中粘贴入你的原始序列（要比你要扩的目的片段两端延伸一点）

3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定

4.点击"pickupprimers"就会出现下一页,上面会列出多种设计，一般来说，第一对引物是最适合的。

同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

（1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对