最新注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程.docx

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最新注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程

注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程

本品系由含有高效表达人促卵泡激素基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经过细胞培养，分离和高度纯化后冻干制成。

含有维持其稳定性作用的保护剂，不含防腐剂和抗生素。

适应症为

不排卵（包括多囊卵巢综合症[PCOD]）且对枸橼酸克罗米酚治疗无反应的妇女。

对于进行超排卵期或辅助生育技术，如体外受精－胚胎移植（IVF）、配子输卵管内移植（GIFT）和合子输卵管内移植（ZIFT）D的患者，本品可刺激多卵泡发育。

1．基本要求

1.1设施与生产质量管理

按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。

1.2原料及辅料

应符合现行《中华人民共和国药典》2005版二部或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。

未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。

1.3生产用水

生产用水源水应符合饮用水标准，纯化水及注射用水应符合现行《中华人民共和国药典》2005版二部标准。

1.4生产用器具

直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。

2．制造

2.1工程细胞

2.1.1名称及来源

重组人促卵泡激素工程细胞系由带有人促卵泡激素α和β链基因的重组质粒共转染的CHO-K1细胞系。

2.1.2种子库建立、传代及保存

从原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库传代，扩增后冻存于液氮中，建立工作细胞库。

每次传代不超过批准的代次。

细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。

2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定

应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。

2.1.3.1外源因子检查

细菌和真菌（附录XIIA）、支原体（附录XIIB）、病毒检查（附录XIIC）。

2.1.3.2细胞鉴别实验

应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传学标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。

2.1.3.3重组人促卵泡激素表达量

应不低于原始细胞库细胞表达量。

2.2原液

2.2.1细胞的复苏与扩增

从工作细胞库来源的细胞复苏后，于无血清、无蛋白培养基中进行传代和扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。

2.2.2细胞培养液

生产用培养液应不含血清、蛋白质。

2.2.3细胞培养

细胞培养全过程应严格按照无菌操作，细胞培养时间根据细胞生长情况而定。

2.2.4分离纯化

收集的培养液经过超虑法进行浓缩，经多步色谱纯化后得到高纯度的重组人促卵泡激素，即为重组人促卵泡激素原液。

除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。

2.2.5原液检定

按照3.1项进行。

2.3半成品

2.3.1配置与除菌

原液加入适宜的稳定剂，并用缓冲液稀释。

除菌过滤后即成半成品。

2.3.2半成品检定

按照3.2项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2分装及冻干

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

半成品应及时分装、冷冻，冻干的全过程中，制品的温度应不高于30℃。

2.4.3规格

75IU/瓶。

2.4.4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1原液检定

3.1.1性状

应为无色澄明液体

3.1.2鉴别

3.1.2.1在氧化亚基项下记录的色谱图中，供试品主峰保留时间应与对照品一致。

3.1.2.2在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品一致。

3.1.2.3肽图（至少每半年测定一次）

取本品，照附录1测定，肽图谱应与对照品一致。

3.1.2.4N末端氨基酸序列（至少每一年测定一次）：

将本品烷基化处理，再经HPLC分离纯化得到、链后，通过Edman降解法测序，两条链N末端15个氨基酸序列分别为：

链：

A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-T-L-Q-E-N，链：

N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E，其中X代表未测出氨基酸，可能有修饰？

。

3.1.3检查

3.1.3.1等电点

取本品，照附录2测定，等电点主区带应在3.5-5.5之间，供试品主区带应与对照品一致？

。

3.1.3.2解离亚基

取本品（1.0mg/ml）50ul，加2非还原上样缓冲液50ul，混匀即得供试品溶液；取上述供试品溶液10ul，加入190ul1非还原上样缓冲液，混匀后100℃加热5分钟，放冷即得对照溶液（供试品溶液5%）。

依法（药典2005版三部，附录IVC，考马斯亮蓝法），用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，分离胶浓度为12.5%，供试品溶液和对照溶液各取20ul；考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪扫描记录结果。

供试品中解离亚基条带显色应不深于对照溶液中的解离亚基条带（5%）。

3.1.3.3氧化亚基

照高效液相色谱法（中国药典2005年版三部，附录IIIB）测定。

色谱条件与系统适用性试验：

用VydacProteinandPeptideC4柱（25cm×4.6mm，5um，或同等产品），以0.1mol/LTEAP缓冲液（取85％磷酸6.75ml，加水950ml，用三乙胺调pH值至6.00±0.05，加水至1000ml，0.45um滤膜滤过，放置24小时后使用）为流动相A，乙腈为流动相B，0.1%三氟乙酸的80％乙腈溶液为流动相C（洗柱液）；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。

梯度程序为：

时间（min）

A％

B％

C％

100

取本品（0.5mg/ml）200µl，加入1％双氧水溶液4µl，反应30分钟即为系统适用性试验用样品溶液，取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。

相对α亚基保留时间约为0.86的杂质峰即为氧化亚基峰。

测定法：

取本品（0.5mg/ml）？

20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，氧化亚基含量不得高于总蛋白量的10%。

3.1.3.4聚合体

取本品原液浓度不定？

（0.1mg/ml）？

80µl，加入5×非还原样品缓冲液20μl，混匀作为供试品溶液；取供试品溶液适量，用1×非还原样品缓冲液稀释为供试品溶液的2%，作为对照品溶液。

取供试品溶液与对照溶液各25μl，依法检查（药典2005版三部，附录IVC银染法），分离胶浓度为12.5％。

对照品条带应显色，供试品中聚合物带的显色应不深于对照品的主带（2%）。

3.1.3.5唾液酸含量

精密配制浓度分别为0ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、120ug/ml、160ug/ml、200ug/ml的唾液酸对照品作标准曲线；取本品，依法测定（药典2005版三部，附录VIE），唾液酸含量应为1.41-12.84%？

范围太大？

。

3.1.3.6紫外光谱扫描

取本品适量，用原液空白溶剂（10mMPB0.1MNaCl）稀释为200ug/ml，以空白溶剂为参比，在波长230~330nm范围，依法（药典2005版三部，附录IIA）检查。

最大吸收波长应在276±3nm处。

3.1.3.7宿主DNA残留量

取本品，依法测定（药典2005版三部，附录IXB），每剂量重组人促卵泡激素应不高于100pg。

3.1.3.8CHO细胞蛋白残留

取本品，照CHO宿主细胞蛋白ELISA检测试剂盒（Cygnus）方法测定，分别用样品稀释液稀释至1mg/ml作为供试品溶液；取200ng/mlCHO宿主蛋白标准品溶液50ul，并加入200ul供试品溶液，作为回收率实验溶液。

按照试剂盒说明书进行操作。

每1mg重组人促卵泡激素中CHO宿主蛋白残留不得过25ng。

3.1.3.9鼠IgG残留量测定

取本品，依法测定（药典2005版三部，附录IXL），每剂量重组人促卵泡激素中鼠IgG残留应不高于10ng。

3.1.3.10细菌内毒素

依法测定（药典2005版三部，附录XIIE凝胶限量试验），每1mg重组人促卵泡激素应不高于10EU。

3.1.4含量测定

取重组人促卵泡激素对照品适量，用水制成每1ml含有0.1mg的溶液作为对照品溶液。

照高效液相色谱法（中国药典2005版三部，附录IIIB）测定。

用TSKgelG-2000SWXL（30cm×7.8mmI.D.）或其它相应的色谱柱；以磷酸盐缓冲液（取85%H3PO46.74ml，加水800ml，再加Na2SO414.2g，用50％NaOH调pH至6.70±0.05，用水定溶为1000ml后抽滤）为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为214nm。

取对照品20μl，注入液相色谱仪,记录色谱图，以人促卵泡激素峰计，理论塔板数应不小于1000；另取供试品适量注入液相色谱仪,记录色谱图，按外标法计算，即得。

3.1.5生物活性测定

取本品依法检定（中国药典2005版二部，附录XIIM卵泡刺激素生物测定法检定），每1mg重组人促卵泡激素生物活性应不低于9000IU。

3.2半成品检定

3.2.1细菌内毒素检查

依法（药典2005版三部，附录XIIE凝胶限量试验）检查，每6μg？

重组人促卵泡激素不得过2EU？

3.2.2含量测定

按照成品含量测定项下方法进行，根据结果对半成品分装体积进行微调，保证成品蛋白含量。

3.3成品检定

3.3.1性状

本品为白色疏松体。

复溶后为无色澄明液体。

3.3.2鉴别试验

3.3.2.1在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。

3.3.2.2供试品、抗体如何配制？

依法检定（药典2005版三部，附录VIIIB，免疫斑点法），应符合规定？

。

3.3.3.检查

3.3.3.1复溶时间

取本品，每支加注射用水0.5ml溶解，溶解时间不得过2分钟。

3.3.3.2不溶性微粒

取本品，用注射用水溶解后，依法（中国药典2005年版二部附录IXC）检查，每瓶中10m以上的微粒不得过6000粒；25m以上的微粒不得过600粒。

3.3.3.3水分

取本品，依法（药典2005版三部，附录VIID第一法B库仑滴定法）检查，含水分不得过3.0％。

3.3.3.4酸碱度

取本品，每支加附带注射用水？

0.5ml溶解，依法（药典2005版三部，附录VA））检查，pH应为6.5－7.5。

3.3.4聚合体

取本品，每瓶加入80µl注射用水溶解，加入5×非还原样品缓冲液20μl，混匀作为供试品溶液；取供试品溶液10µl，加1×非还原样品缓冲液490µl作为对照溶液。

取供试品溶液与对照溶液各25μl，依法检查（药典2005版三部，附录IVC银染法）对照溶液条带应显色，供试品中聚合物带的显色应不深于对照溶液的主带颜色（2%）。

3.3.5氧化亚基

色谱条件与系统适用性试验照高效液相色谱法（中国药典2005年版三部，附录IIIB）测定。

色谱条件与系统适用性试验：

梯度程序为：

时间（min）

A％

B％

C％

100

取本品（0.5mg/ml）?

200µl，加入1％双氧水溶液4µl，反应30分钟即为系统适用性试验用样品溶液，取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。

相对α亚基保留时间约为0.86的杂质峰即为氧化亚基峰。

需确认！

测定法取本品适量，每瓶加水100μl溶解，合并，混匀作为供试品溶液，取供试品溶液200µl注入液相色谱仪,记录色谱图，按峰面积归一化法计算，氧化亚基不得过10%。

3.3.6含量测定

取重组人促卵泡激素对照品适量，用水制成每1ml含有0.03mg的溶液作为对照溶液。

取本品，每瓶加水250μl溶解作为供试品溶液，照高效液相色谱法（中国药典2005版三部，附录IIIB）测定。

分别取对照品和供试品100μl，注入液相色谱仪,记录色谱图，以人促卵泡激素峰计，理论塔板数应不小于1000；按外标法计算，即得。

重组人促卵泡激素含量应为标示量的90%～110%。

3.3.7生物活性测定

取本品，供试品、标准品如何配制？

依法（药典2005版二部，附录XIIM卵泡刺激素生物测定法检定），重组人促卵泡激素的生物活性应为标示量的80%～150%。

3.3.8无菌检查

取本品，用注射用水溶解，依法（药典2005版三部，附录XIIA膜过滤法）检查，应符合规定。

3.3.9细菌内毒素

取本品，用注射用水溶解后，依法（药典2005版三部，附录XIIE凝胶限量试验）检查，每支成品含细菌内毒素不得过5EU。

3.3.10异常毒性

取本品，用注射用水溶解，依法（药典2005版三部，附录VIIF小鼠实验法）检查，应符合规定。

4．保存、运输及有效期

低于室温下保存及运输，有效期暂定2年。

5．使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定。

6．附录

6.1肽图检测方法

6.1.1仪器及耗材

恒温水浴、磁力搅拌器、小型冻干机、氮气瓶、台式离心机、透析袋（3-10kd）、超滤离心管（5kd孔径，4ml）、通风橱。

6.1.2试剂和溶液

6.1.2.1盐酸胍溶液（6mol/L）

称取盐酸胍14.3g至25.0ml容量瓶，加水溶解并定容，即得。

6.1.2.2TE缓冲液（Tris，0.2mol/L；EDTA，1mmol/L，pH8.3）

称取Tris1.2g，EDTA18.6mg加40ml水溶解，用2mol/L盐酸调节pH至8.3，移入50ml容量瓶，用水定容。

6.1.2.3还原及酰化试剂

盐酸胍缓冲液：

取盐酸胍溶液1.2ml，TE缓冲液0.4ml，混匀即得（用前配制）。

DTT溶液（9.0mg/ml）：

称取DTT约9mg，加入1.0ml盐酸胍缓冲液，2~8℃保存。

碘乙酸溶液（130mg/ml）：

称取碘乙酸65mg，加入0.5ml盐酸胍缓冲液溶解，用铝箔避光保存，氮气充封后存于-20℃。

6.1.2.40.1%TFA溶液

取100ulTFA，加入100ml水中，室温1月。

6.1.2.5含0.1%TFA的45%乙腈溶液，2~8℃保存1月。

6.1.2.6V8蛋白酶缓冲液（Tris-HCl50mM，pH7.8）

称取Tris0.6g，溶于80ml水，2mol/LHCl调节pH至7.8，定容至100ml，2~8℃保存1月。

6.1.2.7流动相A：

5%乙腈，0.1%TFA的水溶液。

6.1.2.8流动相B：

90%乙腈，0.1%TFA的水溶液。

6.1.3样品溶液制备：

6.1.3.1对照品溶液制备：

取果那芬对照品适量，用水透析后离心浓缩至浓度约为3mg/ml。

6.1.3.2供试品溶液制备：

取原液，同法制备。

6.1.4去糖基化

6.1.4.1取对照品和供试品各150ul，加入20ul10PNGaseF缓冲液，按照说明书要求分别加入6ulSDS/-巯基乙醇溶液和6ulNP-40溶液，混匀后加入5ulPNGaseF酶，30℃保温24小时。

6.1.4.2100℃处理10分钟灭活糖苷酶。

6.1.4.3加水稀释至4ml，用4ml超滤离心管离心除盐，并缩小体积至200ul并干燥样品。

6.1.5还原烷基化

6.1.5.1还原：

将干燥样品回溶于200ul盐酸胍缓冲液中，加入100ulDTT溶液，氮气流处理，封口后37℃反应1小时。

6.1.5.2烷基化：

在上述样品管中加入20ul碘乙酸溶液，氮气流处理，封口后37℃反应1小时，加入300ul0.1%TFA溶液终止反应。

再加入30ul-巯基乙醇，通风橱内操作,室温反应15min。

6.1.5.3用水透析脱盐后冻干样品。

6.1.6V8蛋白酶切

6.1.6.1蛋白酶溶液制备：

取酶适量，用水溶解制备为1mg/ml。

6.1.6.2取冻干样品，每管加入300ul蛋白酶缓冲液（Tris-HCl50mM，pH7.8）回溶,加入15ul蛋白酶溶液，37℃反应16小时。

6.1.7RP-HPLC分析

色谱柱：

C18，300Å、5m、4.6250mm。

色谱条件：

波长：

214nm；流速：

1.0ml/min；柱温：

30℃，进样量：

180ul/针。

洗脱条件：

T（min）流动相A（%）流动相B（%）

01000

31000

158020

456535

604060

610100

700100

711000

6.1.8观察结果。

6.2等电点测定

6.2.1主要仪器：

Pharmacia平板电泳仪（或者同等产品）、电泳冷却板、制胶模具。

6.2.2主要试剂：

丙烯酰胺、N－甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸氨（AP）、TEMED、pI等电点标准蛋白marker、载体两性电解质pH3~10、甲基红。

6.2.3溶液配制

6.2.3.110%丙烯酰胺贮液

称取丙烯酰胺5.0g，甲叉双丙烯酰胺0.15g，加水溶解，定容至50ml，滤纸过滤。

6.2.3.2电极液

阳极液:

1mol/L磷酸溶液（取浓磷酸3.2ml，加水至50ml）；阴极液:

1mol/LNaOH溶液。

6.2.3.350%甘油

称取甘油50g加水混合均匀后定容至100ml。

6.2.3.4甲基红指示剂

称取甲基红0.1g，加入7.4mlNaOH（0.05mol/L）使之溶解，加水定容至200ml。

6.2.3.5固定液（10%TCA）

称取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml。

6.2.3.6脱色液

取甲醇25ml，乙酸5ml，加水至100ml。

6.2.3.7染色液

称取考马氏亮蓝R-2500.1g，用脱色液定容至100ml

6.2.3.80.025mol/L磷酸缓冲液pH7.0

溶液A：

Na2HPO4·12H2O18.81g，加水溶解并定溶于100ml。

溶液B：

柠檬酸钠·2H2O2.39g，加水溶解并定溶于100ml。

取溶液A82.4ml，溶液B17.6ml，混匀，取25ml加水至1000ml即得。

6.2.4操作步骤

6.2.4.1凝胶制备：

按照下表进行配制

10%丙烯酰胺贮液

2.5ml

载体两性电解质

0.35ml

50%甘油

0.5ml

水

1.25ml

10%APS

25l

TEMED

6.2.4.2样品制备处理

依具体情况而定，如果供试品和对照品溶液盐浓度过高，应先透析或过滤除盐。

样品浓度制成0.5~2.0mg/ml。

分别取供试品及对照品溶液各10l，加入两性电解质2l，加入甲基红试液0.5l。

6.2.4.3电泳

6.2.4.3.1点样：

将滤纸片剪成0.5cm×0.5cm大小，排放在凝胶上，分别将样品、对照品及等电点标准液各10l点在滤纸上。

6.2.4.3.2预电泳：

开机预冷电泳槽冷却板，在冷却板中央滴加石蜡油，将载胶的支持膜铺在油上，6℃预冷30min；将电极条分别用阴、阳极电极液充分湿润，吸去多余电极液后平行置于凝胶两端。

将电极压在电极条上，200V预电泳20min。

6.2.4.3.3电泳：

200V恒压20min，然后根据情况调整电压，直至电流不再降低为止。

6.2.4.4显色

胶片于固定液中固定30~60min；于脱色液中平衡20min；于染色液中染色20~60min。

最后于脱色液中脱色至本底无色。

6.2.5观察结果

根据等电点标准蛋白判断样品等电点。

注射用重组人促卵泡激素制造及检定规程起草说明

我公司研制生产的注射用重组人促卵泡激素（rhFSH），是利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞分泌型表达技术，使目的蛋白直接分泌于培养基中，经过一系列的下游纯化及冻干等工艺步骤和严格的质量检验而获得的真核基因工程产品。

为了获得高质量的基因工程重组人FSH产品，在制备和检定过程中，我们按《中华人民共和国药典》（2005版）和《中国生物制品规程》（2000版）对生物制品质量控制要点的要求，结合连续中试生产的三批样品（批号：

20050701、20050702、20050703）的质量研究结果，参照同类进口产品果纳芬质量标准，起草了重组人促卵泡激素原液和成品的检定规程，现说明如下：

1．重组人促卵泡激素原液

1.1性状

根据中试产品质量研究结果，三批注射用重组人促卵泡激素原液均为无色澄清液体，无肉眼可见不溶物。

由于本品为注射剂，依据《中华人民共和国药典》2005版二部对注射剂标准的要求，规定本品为无色澄清液体，不得含有肉眼可见不溶物。

1.2鉴别

本产品含量和氧化亚基项目的检查都采用了HPLC的方法，在此基础上，我们通过将待测样品与对照品保留时间的对比，清晰的反应出了蛋白质的性质，对产品进行了可靠的鉴别，三批注射用重组人促卵泡激素原液的主峰保留时间与对照品主峰保留时间均一致

1.3肽图

为了确证产品结构的正确性，我们规定至少每半年进行一次产品的肽图谱分析。

由于重组人促卵泡激素是一种真核细胞为宿主表达的经糖基化修饰的蛋白，我们通过糖酶和TPCK处理的胰蛋白酶先后作用待测样品和对照品，将其蛋白链分解成若干肽段，然后利用RP－HPLC进行了有效地分离，结果表明三批注射用重组人促卵泡激素原液肽图谱与果纳芬？

对照品完全一致。

1.4等电点

根据文献报道

（1），重组人促卵泡激素的等电点主区带应在4.0-5.2之间。

而在我们建立的等电聚焦电泳系统结果分析表明，三批注射用重组人促卵泡激素原液与果纳芬对照品的主区带分布一致，均在3.5-5.5之间

1.5N－末端氨基酸序列

为了确证产品结构的正确性，我们规定至少每年测定一次产品的N－末端15个氨基酸序列。

将本品烷基化处理，再经HPLC分离纯化得到、链后，通过Edman降解法测序，两条链N末端15个氨基酸序列分别为：

链：

A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-T-L-Q-E-N，链：

N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E，其中X代表未测出氨基酸，可能有修饰。

这与文献报道的理论序列是相同的

1.6解离亚基

依法（药典2005版三部，附录IVC，考马斯亮蓝法），用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪扫描记录结果，同法参考果纳芬的检定标准，将解离亚基的含量定为小于5％。

1.7氧化亚基

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