土壤中砷的处理.docx

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土壤中砷的处理

土壤中砷的处理

　1引言

　　砷是一类广泛存在于土壤中的具有致癌作用的类金属元素，主要来源于含砷农药、化肥的施用及含砷污水灌溉等.据雷鸣等（2008）的调查，湖南郴州、衡阳等地稻田砷污染较严重，土壤砷含量最高达245mg·kg-1，导致大米砷含量超标，造成严重的健康威胁和巨大的经济损失.同时，砷作为一种变价元素，不同价态毒性及生物有效性有较大差异，如三价砷生物毒性是五价砷的60~100倍.此外，水分可通过改变土壤氧化还原电位、铁锰氧化物等变价元素的价态而影响砷的生物有效性及其环境风险，如淹水导致As（Ⅴ）向As（Ⅲ）转化，提高了土壤中As（Ⅲ）的含量;同时，土壤水分会影响水稻籽粒中砷含量，灌浆期后湿润灌溉可显著降低糙米中砷含量.研究表明，稻田土壤水分含量可影响并改变土壤溶液及稻米中砷含量，而控制土壤水分含量是解决稻田土壤砷污染问题的有效途径之一，并揭示出水分是影响砷毒性的主要因素之一，尤其是在稻田土壤上.因此，需对二者作用关系进行系统探讨.

　　土壤酶是土壤的重要组成成分，土壤中所有生物化学过程的发生都得益于土壤酶的作用.酶促反应动力学是研究酶催化反应速度及各种因素（如污染物等）影响的方法，其结果不仅可显示土壤酶总量的高低，而且还可以反映酶与底物、重金属污染物等之间结合的紧密程度和作用过程，从而能深入探讨污染物与酶作用机理，故被认为是一种理想的研究手段.目前，国内外学者对砷的土壤酶效应进行了研究，发现有激活、抑制和无关3种作用，如As（Ⅴ）会抑制碱性磷酸酶及芳基硫酸酯酶活性，而As（Ⅲ）则不敏感;砷能激活土壤脲酶活性.对不同水分下土壤酶作用机理的研究也有零星报道，如Zhang等（2009a;2009b）发现，土壤脱氢酶活性及酶促最大反应速度均随水分含量升高而增加;高水分含量增强了磷酸酶与底物亲和力，提高了最大反应速度;淹水对土壤脲酶动力学参数无显著影响（隽英华等，2011）.但目前对不同水分条件下砷与酶作用机理的研究则鲜见报道.因此，本文拟采用室内模拟培养试验的方法，从酶动力学角度研究水分对砷与土壤碱性磷酸酶关系的影响，揭示砷对碱性磷酸酶的作用受水分影响的机理，以期为稻田土壤砷污染的准确监测和保护修复提供依据.

　　2材料与方法

　　2.1供试土壤

　　供试土壤为采自江苏省中国科学院常熟农业生态试验站的水稻土（底潜铁聚水耕人为土，EndogleyicFe-accumuli-StagnicAnthrosols）.采样时，先去除0~5cm表层土，采用五点法取5~20cm土样，混匀风干，过1mm尼龙筛备用.常规方法测定土壤基本化学性质（鲍士旦，1997），结果为有机质47.69g·kg-1，pH=6.93（水土比2.5:

1），全氮3.1g·kg-1，全磷0.61g·kg-1，全钾18.02g·kg-1，碱解氮10.66mg·kg-1，速效磷11.74mg·kg-1，速效钾112.90mg·kg-1，阳离子交换量26.20cmol·kg-1，游离氧化铁2.43g·kg-1，总砷8.70mg·kg-1，有效砷（0.5mol·L-1NaHCO3）0.32mg·kg-1.

　　2.2试验方案

　　向600g土样中添加不同浓度的As（Ⅴ）（Na3AsO4·12H2O，AR）溶液，使As（Ⅴ）含量分别为0、25、50、100、200、400mg·kg-1，并调节土壤含水量为最大持水量（WHC）的35%、65%、110%，分别代表土壤水分条件为干燥、湿润及淹水.混匀后加盖密闭，于（25±1）℃的培养箱中暗培养，期间称重法控制土壤水分含量;定期（1、8、15、30d）取样测定并计算酶动力学参数.

　　土壤碱性磷酸酶动力学测定：

在3.00g土壤中加入0.25mL甲苯，15min后添加20mL采用缓冲液（pH=9.4）配制的不同浓度（0.0010、0.0025、0.0050、0.010mol·L-1）的磷酸苯二钠溶液，37℃培养，定时取样，采用磷酸苯二钠比色法测定土壤磷酸酶活性（关松荫，1987）.每个处理重复3次，并设无底物和无土壤处理为对照.

　　2.3数据处理

　　土壤酶动力学参数Km、Vmax的计算参考文献，具体而言，米氏常数Km和最大反应速度Vmax可用Michaelis方程的积分式计算：

　　经数学变换和整理得到：

　　式中，t为酶促反应时间（h），S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度（mmol·L-1）.可见，上式是一条1/t×ln（S0/St）对1/t×（S0-St）的直线方程.在反应期间通过测定不同时间段利用的底物浓度（或生成的产物浓度），并通过线性回归，即可求得Km和Vmax值.

　　土壤酶促反应速度常数k计算如下（和文祥等，2001）：

　　式中，t为酶促反应时间（h），S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度（mmol·L-1）.

　　砷对土壤酶抑制常数Ki的计算见文献（朱铭莪，2011;谭向平，2014），其中，竞争性抑制动力学方程为：

　　式中，Ki为抑制常数（mmol·L-1）;Km*为抑制剂存在下表观米氏常数（mmol·L-1）;C为外源砷剂量（mg·kg-1）.

　　线性混合抑制动力学方程为：

　　式中，Vmax*为抑制剂存在时酶表观最大速率（μg·g-1·h-1）;KS*为酶-底物表观解离常数（mmol·L-1）.对于线性混合型抑制，V*max=Vmax/β，Ks*=（α/β）Ks;其中：

　　式中，I为抑制剂浓度（mg·kg-1），δKi为酶-底物-抑制剂解离常数（mmol·L-1），δ可表示酶-抑制剂对底物的亲和力.

　　采用MicrosoftExcel2013和SPSS19.0软件对数据进行方差分析及模型拟合，LSD法对各处理间差异进行多重比较.

　　3结果与分析

　　3.1砷对碱性磷酸酶酶促反应动力学特征影响

　　3.1.1米氏常数Km的变化

　　米氏常数Km表征酶与底物结合牢固程度，在数值上等于初速度达到最大反应速度1/2时的底物浓度.Km值越小，表明酶与底物结合越牢固，亲合力越大（和文祥等，1997）.从表1可以看出：

①不同水分下碱性磷酸酶Km总体呈现35%WHC>65%WHC>110%WHC的变化规律，3个水分下Km均值分别为6.08、4.78、3.66mmol·L-1，表明随水分含量增加，土壤碱性磷酸酶与底物的亲和力增强，酶与底物更易结合.②除个别处理外，其余处理土壤碱性磷酸酶Km随砷含量增加而显著增大，表明砷污染导致碱性磷酸酶与底物亲和力减弱.③不同处理下Km值虽有差异，但处于同一数量级，整个试验处理中Km变幅为2.34~10.95mmol·L-1.④不同培养时间的Km变化较小，如砷含量为100mg·kg-1时，35%WHC、65%WHC、110%WHC下Km变化范围分别为5.12~6.44、4.23~5.54、2.35~4.41mmol·L-1，表明培养时间对土壤酶与底物亲和力影响较弱.⑤相关分析显示，35%WHC、65%WHC下砷含量与Km呈显著相关（r>0.913*），而110%WHC下则相关性较差，表明干燥条件下砷显著降低土壤酶与底物的亲和力.

　　表1供试土壤碱性磷酸酶米氏常数

　　3.1.2酶促反应最大反应速率Vmax的变化

　　最大反应速率（Vmax）可表征酶-底物复合物分解为酶和产物的能力及土壤中酶的总量，在数值上等于酶完全被底物饱和时的催化反应速度（和文祥等，2010）.从表2看出：

①Vmax随水分含量增加显著降低，如第30d，对照处理65%WHC、110%WHC的Vmax较35%WHC下分别降低了35.32%、40.94%，而当砷含量达200mg·kg-1时，降幅分别达到42.66%、52.86%.②除个别处理外，随外源砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax间变化较小，最大变幅为26%，且处理间差异不显著，表明干燥和湿润条件下砷对土壤酶-底物复合物的解离影响较弱;110%WHC下Vmax则显著降低，揭示出淹水下砷污染阻碍了碱性磷酸酶-底物复合物解离.③110%WHC下，随砷含量增加Vmax降幅增大，可能是由于水分饱和条件下As（Ⅴ）向As（Ⅲ）转化的缘故（曾希柏等，2010）.④35%WHC、65%WHC下，Vmax随培养时间延长而增加，如砷含量为100mg·kg-1时，两个水分下第30d的Vmax值分别为第1d的1.32、1.15倍，表明酶-底物复合物的分解速率加快，砷的毒性减弱.⑤利用Y=A/（1+B×C）模型（Speiretal.，1999）拟合Vmax与砷含量（C）的关系.结果（表3）发现，仅110%WHC下二者呈显著负相关关系（r>0.912*），表明淹水下Vmax可在一定程度上监测土壤砷的污染程度，且机理为完全抑制作用.⑥生态剂量值（EcologicalDose）ED10是指酶活性变化10%时外界污染物的浓度，可表征土壤轻度污染时的临界浓度（Doelmanetal.，1989）.计算获得水稻土砷污染ED10值为73.52~156.67mg·kg-1.

　　表2供试土壤碱性磷酸酶最大反应速率Vmax

　　表3碱性磷酸酶最大反应速率Vmax与砷含量（C）的拟合关系

　　3.1.3Vmax/Km及反应速度常数k的变化

　　在较大范围内，Vmax/Km是衡量酶促反应初速度的重要指标，可作为土壤质量的指标之一.反应速度常数k是酶总体催化能力的指标，从本质上反映酶促反应是“快”还是“慢”，且其值与底物浓度无关（和文祥等，2009）.从表4可知：

①Vmax/Km、k随水分含量增加总体呈降低趋势，35%WHC下的Vmax/Km、k显著大于65%WHC、110%WHC下，表明较低水分含量有利于土壤酶催化反应的进行.②3种水分下，Vmax/Km、k均随砷含量的增加而显著降低，表明砷污染本质上降低了酶促反应初速度.③35%WHC、65%WHC下，Vmax/Km、k随培养时间延长而增加，这与Vmax变化规律一致.④利用模型Y=A/（1+B×C）拟合二者关系，结果（表5）表明，Vmax/Km、k在一定程度上可作为土壤砷污染程度的监测指标，且砷对土壤碱性磷酸酶的作用机理为完全抑制（包括竞争性抑制和非竞争性抑制）作用（Speiretal.，1999）.⑤计算获得Vmax/Km、k的ED10范围分别为20.45~70.87mg·kg-1和66.00~131.89mg·kg-1.⑥综合Vmax的结果可看出，Vmax/Km获得的ED10较小，且不同水分下均呈现出较好相关性，表明Vmax/Km对砷污染最为敏感，且其比Vmax可更全面、准确地表征不同水分下土壤砷污染程度.⑦根据剂量最小最敏感原则获得水稻土砷轻度污染的临界值为20.45mg·kg-1，此值与国家土壤质量标准中的二级污染标准值（25mg·kg-1）较为接近，从侧面表明动力学参数Vmax/Km可较好评价土壤砷污染程度.

　　表4供试土壤碱性磷酸酶动力学参数Vmax/Km及反应速度常数k

　　表5碱性磷酸酶动力学参数Vmax/Km、k与砷含量（C）的拟合关系

　　3.2砷对碱性磷酸酶抑制动力学特征影响

　　抑制剂对土壤酶抑制类型一般包括竞争性、非竞争性、反竞争性及线性混合抑制等（朱铭莪，2011）.由表1、2可知，随砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax变化较小，Km则显著增大，显示此水分下砷酸根离子会与底物竞争碱性磷酸酶同一活性中心，抑制类型属于典型竞争性抑制;而110%WHC下，随砷含量增加，Vmax降低，Km总体增大，表明淹水时二者作用为线性混合抑制类型（包括竞争性抑制和非竞争性抑制）（朱铭莪，2011）.

　　为进一步了解砷对磷酸酶的抑制特征，