显微与电镜技术.docx

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显微与电镜技术

生物显微技术与电镜技术

第一篇生物显微制片技术

第一章概论

第一节制片的目的和任务

第二节生物制片的分类法

第二章生物显微制片的步骤和原理

第一节取材和固定

第二节洗涤和脱水

第三节透明和透明

第四节浸透及包埋

第五节切片

第六节贴片脱蜡与染色

第七节封固

第三章其它切片法

第一节冷冻切片法

第二节火棉胶制片法

第二篇显微照相术

第一章显微镜

第一节显微镜的种类

第二节显微镜的光学原理

第三节显微镜的使用及其注意事项

第四节各种显微镜

第二章显微镜几种常用的附件

第一节游标尺的使用

第二节显微测微尺

第三节描绘器

第四节投影屏和投影目镜

第五节共览装置

第三章显微照相术

第一节不同类型的显微照相装置及其功能

第二节显微照相对物镜、目镜及聚光镜的选择

第三节照相的程序

第三篇电子显微技术

第一章概论

第二章电子显微镜的原理和结构

第一节电子显微镜的原理

第二节电子显微镜的结构

第三章扫描电子显微镜

第一节扫描电镜的一些基本概念

第二节扫描电镜的原理及特点

第四章电镜生物样品的制备

第一节透射电镜生物样品的制备

------超薄切片的方法

第二节扫描电镜生物样品的制备

附录一制片技术实例

实验一涂布法

实验二石蜡切片法

（一）

实验三石蜡切片法

（二）

实验四透射电子显微镜生物标本的制备方法

实验五扫描电子显微镜样品的制备方法

第一篇生物显微制片技术

第一章概论

第一节制片的目的和任务

制片技术是生物科学必不可少的研究手段。

人类生活在大自然中，虽很早就认识和研究自然界中形形色色的生物，但起初只限于在外部形态、种类以及生长发育等方面的研究，对于内部细微结构的奥秘，直到十七世纪中叶发明了显微镜后，才开始借助工具进行探索。

当时限于工具的简陋及科学发展的水平，观察和研究的方法是十分简单的，到了址九世纪，由于工业革命促进了物理学和化学的发展，进而为显微技术革新的发展提供了丰富的知识和新技术装备，使显微技术产生了根本性的变化。

制片技术就是在这样的基础上形成为一门新的学科，从而推动生物科学和日益发展。

当然，生物科学迅速发展，也要求投影片技术的内容更加充实和完备，以达到各种观察和研究的目的。

由于各种材料的性质及观察研究的目的不同，要制成适合于显微镜下观察的薄片，并要显示出结构的正确的清晰，因而产生了多种制作生物制片的技术和方法。

如平时观察细小透明的生物体或组织材料，可无需经切片手续，只需封在一滴水中就能在显微镜下进行观察；对易于分离的组织，可在载波片上涂上一层薄层，经染色或不染色做成涂片；大而复杂的材料，可以用刀或用切征机切成薄片；若要进一步研究其细微的结构，尚须经过若干制片步骤；为了显示组织间更加清晰的结构，还可进一步染色等等。

总之，制片方法是极其繁多的，而且仍在不断地发展和充实。

由于制片技术在生物科学的领域内占有重要的地位，因此已成为生物学工作必须掌握的一项技术，也是水产养殖学科不可或缺的基本研究手段之一。

本篇以石蜡制片技术为主线来阐述制片的基本方法和原理，在掌握基本方法和原理的基础上，其他生物制片法则可融会贯通，以便在工作中达到灵活应用的目的。

第二节生物制片的分类法

生物制片的种类，从不同的角度出发其分类是不一的，如从保存时间的长短可分为“临时制片”和“永久制片”两大类，而目的常根据其制片的方法来分，采用如下的分类方法：

一、活体观察

将生物的个体或其一部分，就其原来的状态置于载波片上，加上一滴水和盖波片进行镜检，从而达到预定的检查目的。

此法既简便而且又节省时间，并能观察到活体的情况，也不需要什么特殊的设备，但因此法未经过其他处理，常常因组织过厚，光线不易透过，且活体材料又多为无色透明的，结果常难取得满意的效果，同时不易作长期的保存。

二、切片法即是利用锋利的刀具将材料切成薄片。

简便的切片法即是利用刀片或剃刀将材料切成薄片后，置于载玻片上加盖进行活体观察；或经处理、染色等步骤做成制片，此法可制成临时制片，必要时亦可制成永久制片。

该切片法在制片技术中甚为重要，因为无需特殊设备便能及时地观察到生活组织的内部结构。

另处，有些研究有必要先作简单切片进行观察，才能决定材料是否符合目的和要求。

完善的切片法如石蜡切片法，火棉胶切片法等，需要经过一系列的过程和各种药剂，染色剂处理，手续甚为复杂，而且要有一定的设备，这些方法由于经过了各种处理，使组织内所含万分发生物理和化学的作用，而显示其差异，以便于观察和研究，同时可用长时间的保存。

因此，切片法在生物显微片技术中占有极其重要的地位。

三、非切片法

所谓非切片法，即是指不经切片手续，但其不同于活体观察法之点是：

此法常经过药剂的处理，这样组织常被杀死后并经染色做成临时或永久制片。

或包括：

（1）整体封藏法：

用这种方法制片，一般是身体很小或自身为一薄片的低等动物，如无脊椎动物的水螅、草覆虫等。

或脊椎动物胚胎材料：

如鸡胚、蛙胚、猪胚等。

也可取下某一动物体的某部分器官制成封片的，如昆虫的翅、鸟的羽毛、鱼的鳞片等等。

这些材料取下后经固定、脱水、染色等手续就可封藏于玻片内而不需用切片机来切片。

（2）涂片法：

主要是液体或半流动的材料，不能切成薄片则可涂在玻片上，再经固定与染色等手续制成标本。

如：

血液、精液、尿、痰、粪便等，还有细胞学的检查，微生物及原生动物等也可用涂片法制片。

（3）磨片法：

主要用于含有钙盐等矿物质等万分坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿、坚骨、软体动物的介壳、珊瑚虫的骨骼等可不经切片制成磨片标本。

（4）分离法：

为了要观察研究在组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须设法使细胞与细胞的间质消除，细胞便各自分离开来，再经染色后制成切片的方法叫分离法。

一般有二种方法：

1浸渍分离法：

是利用药品使细胞间质溶解，细胞便能自动分离开来，取出单个细胞经过染色、脱水、透明等处理封成片子。

2撕碎法：

材料经固定或浸渍到一定的程度后用解剖针在解剖镜下撕开的方法，如观察单个的神经纤维即可用此种方法制片。

（5）压碎法：

一些柔软的材料可夹在玻片或盖玻片间进行压碎或压开染色后进行观察。

第二章生物显微制片的步骤和原理

前面已经提到生物显微制片的方法很多，其制片也繁简不一，为了叙述方便和便于学习，本章采用应用最广泛，过程复杂完善的制片方法——石蜡制片法予以叙述。

从动物体取下材料开始，到制成切片标本为止，其间必须经过以下各个步骤：

（1）取材与固定：

这是制片切片的第一步，首先必须把动物体的组织杀死，度设法把他原来的结构保存下来，以但观察研究，一般用化学药品把它固定，这种化学药品称为固定剂，它有杀死兼固定和硬化细胞组织的作用。

（2）洗涤：

组织经过一定的固定时间以后，内部渗入很多固定剂，必须及时地把渗入里面的固定剂洗支，否则固定剂作用过久会产生一些不良后果，如影响染色、产生结晶等，所以在固定以后必须用水冲洗干净。

（3）脱水：

组织中含有大量水分，必须用一些有机溶剂，称为脱水剂的以驱除里面的水分，以利组织的保存和下一步的透明，浸蜡诸步骤的进行。

因为透明剂和石蜡与水是不能相溶的，所以必须先脱支水分，方能进行以下步骤。

（4）透明：

其目的是便于浸蜡包埋。

因为石蜡不能与脱水剂混合，只能与透明剂混合，因此在脱水后组织里充满的脱水剂必须用透明剂所代替，这样才能使石蜡熔剂渗入。

（5）浸蜡：

组织块在完全透明后，支持剂石蜡等就容易透入，它的目的一方面使组织变硬有利于切片，另处也使组织块内各组分间的相互位置保持一定，基本上维持生活时的状况。

石蜡的透入需要在一定的温度下才能进行。

（6）包埋：

把透足石蜡的组织包埋在石蜡里，成为一定的开形状以便切片。

（7）切片：

把包埋好的组织块用切片机进行切片，根据观察的要求确定切取的方向和厚度。

（8）贴片：

用粘贴剂使切出的薄片平铺粘贴在载玻片上以便于染色和观察。

一般常用甘油蛋白贴剂。

（9）脱蜡与染色：

石蜡作为支持剂在切片和贴片后就完成了使命。

为便于观察，须脱支石蜡并对切片进行染色，染色的其目的是使细胞或组织的各部分染上不同的颜色，产生不同的折射率以显示它不同的构造。

染色方法有多种可以根据要求不同而选择。

（10）封藏：

切片染好以后用一种胶类物质称封藏剂的封好，以利于长期保存。

以上为切片制作的一般步骤概述，其详细过程，原理将在以后各章节中叙述。

第一节取材和固定

当我们选择某种材料制成切片时，应立刻把材料加以处理，否则组织结构很快会发生萎缩，死亡或分解等变化。

因此，材料在选定后，即需将动植物的组织迅速地予以杀死和固定下来，使它保持生活时之自然状态，而不至于在死亡前后，在形态及结构上发生变化。

下面分别讨论有关这一过程的原理，性质和作用等问题。

一、杀死：

在这里具有两层含义，其一是把用于取材的动物处死，取下需做切片的材料（包括外科病理手术或活检切除下的材料）。

动物杀死的方法很多，常根据动物大小，种别及观察目的而定。

例如青蛙、小鼠等类较小的动物，可用断头法杀死，即用大号剪刀剪断颈部，迅速将动物倒提放血，如反射尚未消失可用金属探针插入脊髓管，破坏其脑脊髓。

一些较大的动物例如天竺鼠、兔子、猫等可用空气栓塞法，用50亳升的注射器从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。

注入空气的量，视动物大小而定，一般情况下兔猫约注入20—40毫升，狗需注入80——150毫升。

此法迅速方便，但各脏器淤血明显，脑和心可发生人为性病变（心内膜下淤血和脑部变质）。

也可用扑杀法，即用木棒从头后部给予猛击，使其颈椎脱位，延髓急性损伤而死。

或用麻醉或用窒息法：

使动物闷在有乙醚或氯仿的密闷容器内，使麻醉致死，或在容器中通入煤气，其发生急性煤气中毒而死亡。

其中用乙醚麻醉致死的动物常有肺部充血，呼吸道分泌物增多的病变，煤气中毒致死的动物因一氯化碳可使红血蛋白转变碳氯血红蛋白，使动物内脏呈樱桃红色，影响对血液和骨骼的涂片染色（必须在组织固定后，用稀的过氧化氢液处理后再进行）。

这些人为病变，在观察时必须注意分辨。

总之在杀死动物时，无论采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒临死亡状态，以免使动物的组织细胞各组分的结构发生变化，或引起病理假象。

杀死的第二层含义是指用一种或多种化学药品，很迅速地终结生物组织的生命而言。

这一处理要求越快越好，尽量减少改变其生活状态的可能性，所以要选择渗透力很强的化学药品来做为杀死剂，力求在很短的时间内迅速浸入到组织中的每一个细胞内，以避免在生命死亡之前后发生变化，这是选择杀死剂的一个重要原则。

固定：

在杀死的基础上，把组织或细胞按生活的状态固下来，使在以后制片的任何过程中不发生变化。

杀死和固定两者之间的关系是极为密切的，是两个不同的步骤，但又是相互统一。

相互作用的过程，我们常用的杀死剂，一般都兼作固定剂，在选配时就应加以考虑。

保存：

材料经杀死，固定处理后，一般都马上做成切片保存。

但有时若需要反固定的组织在较长的时间内保存下来，不至于发生溶解或其他的变化，我们常用即能固定又能兼作保存作用的固定剂，例如甲醛—醋酸—酒精固定液，材料可长期保存于该溶液中几年或更长时间，也不会变坏。

有的固定剂则不能兼作保存的作用，例如铬酸类的固定剂，在固定作用完成后必须更换保存液，否则材料会变坏。

通常所用保存液为70%的酒精溶液，一般的材料在其中可保存较长的时间而不至变坏。

二、固定的理论

为了使生物体组织或细胞的细微结构及其内含物完整固定起来，在制片的各个步骤中也不至发生变化，通常都是利用化学药品加以处理。

到目前为止，还没有一种化学药品能达到十分完善的效果，使材料在固定后能完全保持它的原来生活状态。

这点也不难理解，因为生命在死亡之前对外来的刺激有强烈的反应，因此，材料经过处理后，就或多或少会发生一