神经干复合动作电位与骨骼肌收缩的关系.docx
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神经干复合动作电位与骨骼肌收缩的关系
综合性实验
实验一神经干复合动作电位与骨骼肌收缩的关系
【实验目的】
利用蟾蜍的坐骨神经干-腓肠肌标本，采用PowerLab多通道同时记录的优点，通过生物电放大器引导并记录神经干复合动作电位；使用机械-电换能器来获得骨骼肌的收缩曲线，两者对照，分析其产生的机制和特点。
【实验原理】
骨骼肌纤维受运动神经纤维的控制，神经纤维受到刺激后，其兴奋延神经纤维以动作电位的形式传导到相应的肌纤维，通过兴奋—收缩耦联，引起肌纤维收缩或舒张。
神经纤维的兴奋表现为细胞膜上的生物电——动作电位的产生和传导，随后，肌细胞产生收缩，反映在张力和长度的变化上，两者产生的机制和表现形式均不相同。
【实验动物】
蟾蜍
【药品与器材】
蛙手术器械，PowerLab8S主机，张力换能器，生物电放大器，桥式放大器，铁架台，肌槽，任氏液。
【实验步骤】
1．标本制备：
蟾蜍坐骨神经标本制备方法参见P19的蟾蜍神经肌肉标本的制备，标本浸在任氏液中约5min，待其兴奋性稳定后实验。
2．仪器装置及程序设置
R3
（1）连接仪器（图6-1）。
图6-1 神经干复合动作电位与骨骼肌收缩实验框图
其中，S1和S2为刺激电极，与PowerLab的outputI相连，R1和R2为记录电极，与生物电放大器相连，R3为接地电极。
（2）参数设置：
启动计算机，打开PowerLab主机电源，在桌面上单击Chart5图标，进入Chart应用程序窗口。
1）选择采样速度为40K/s，显示比例为500:
1。
2）在Channel1显示神经干复合动作电位。
生物电放大器参数设置参见P35的放大器参数设置。
Range为5～10mV，HighPass为0.3～10Hz，LowPass为1KHz。
选50HzNotch来抑制交流干扰。
3）在Channel2显示区域，显示骨骼肌收缩曲线。
桥式放大器参数设置参见P35的放大器参数设置。
Range为200mV，LowPass为100Hz。
如果在BridgeAmplifier设置对话框左侧的信号显示窗口中看不到输入信号，可用鼠标左键单击右侧的zero按钮，系统自动调整输入信号的零位。
单击BridgeAmplifier设置对话框下方的units按钮，进入UnitsConversion（单位转换）对话框。
单位转换的方法参见P36信号幅度范围的设置和单位的转换。
4）在Channel3显示区域，显示刺激方波。
在刺激参数设置对话框下方的StimulatorMarker框中选取Channel3。
刺激设置方法参见P39的刺激输出的设置。
设置完毕后，单击菜单栏的setup，选取stimulatorpanel，弹出StimulatorPanel（刺激面板），在实验中可以方便地由刺激面板来设置刺激频率、幅度和波宽等参数。
①单次刺激：
设置Mode为Pulse，单击Hz选项，Frequency取1Hz，PulseDuration选0.1ms。
选中Setnumberofpulse选项，在Number中键入1，表示一次刺激输出1个刺激方波。
OutputRange为10V，Amplitude为0，然后可在实验中逐渐增大刺激强度。
②双次刺激：
设置Mode为Pulse，单击Hz选项，Frequency取1Hz，PulseDuration选0.1ms。
选中Setnumberofpulse选项，在Number中键入2（双刺激）。
OutputRange为10V，Amplitude选择最大刺激强度。
在实验中通过StimulatorPanel（刺激面板）逐渐增大Frequency（刺激频率）。
③多次刺激：
Frequency取1Hz，PulseDuration选0.1ms。
选中Setnumberofpulse选项，在Number中键入8，其余参数同上。
实验中通过StimulatorPanel逐渐增大Frequency（刺激频率），使骨骼肌收缩表现为单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩。
实验中如要对标本进行刺激，应先用鼠标左键单击开始/停止切换按钮，程序开始采样记录，然后单击刺激面板的Stimulate按钮，即可产生刺激输出，同时Channel3（3通道）显示刺激方波。
（3）连接装置：
把坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌槽上，用丝线把腓肠肌与换能器相连。
3．观察项目
（1）神经干复合动作电位和骨骼肌单收缩与刺激强度的关系：
单次刺激，逐渐增大StimulatorPanel中的刺激强度，记录神经干复合动作电位（分辨刺激伪迹和复合动作电位）和腓肠肌的收缩曲线随刺激强度的增大而变化，并记下波宽0.1ms时的阈刺激和最大刺激强度数值。
（2）以最大刺激强度单次刺激标本。
测量神经干复合动作电位以及腓肠肌单收缩的潜伏期、时程和幅值，测量方法参见P43的实验数据的计算、分析和统计。
比较神经干复合动作电位和腓肠肌单收缩的潜伏期、时程和幅度的差异。
（3）记录骨骼肌的收缩期复合和舒张期复合的曲线：
双次刺激标本，逐渐增大StimulatorPanel中的刺激频率，使第二次刺激分别落在第一个收缩波的舒张期和收缩期。
注意观察收缩产生复合的同时神经干复合动作电位有何变化？
（4）记录骨骼肌的不完全强直收缩和完全强直收缩的曲线：
多次刺激标本，逐渐增大StimulatorPanel中的刺激频率，使骨骼肌的收缩表现为不完全强直收缩和完全强直收缩。
（5）打印上述实验结果。
打印方法参见P45的实验数据的打印。
【注意事项】
（1）分离坐骨神经时，避免过度牵拉神经，绝对不允许用手或镊子夹神经。
（2）股骨要牢固地固定在肌槽的小孔中。
（3）坐骨神经要与刺激电极和记录电极紧密接触，但不要损伤神经。
（4）防止神经、肌肉标本干燥，需经常在神经和肌肉上滴加任氏液，防止标本干燥。
（5）长时间刺激标本可能使骨骼肌的收缩能力下降，因此每个步骤后应让肌肉休息片刻。
（6）把腓肠肌悬挂在换能器上的丝线应松紧适中，不要过长并和换能器平面保持垂直。
（7）实验的采样速度较快，为避免过度消耗硬盘和内存，不要长时间记录。
（8）为了精确测量神经干复合动作电位和骨骼肌单收缩的时程和幅度，可用ZoomWindow来放大所需测量的区域。
【思考题】
1．为什么骨骼肌收缩时可以发生收缩波的复合，而引起骨骼肌收缩的动作电位却没有复合现象？
2．如何区别动作电位和刺激伪迹？
3．为何在双次刺激时，后一个动作电位会随两次刺激间的时间间隔缩短而减小，直至消失？
实验二三种作用于传出神经系统的未知药物的初步辨别
【实验目的】
1．通过药物辨别实验，初步学习药理实验设计的思路及方法。
2．深入掌握三个重要的传出神经系统药物的作用特点，加深对、肾上腺素受体激动药和阻断药药理作用的理解。
3．观察酚妥拉明对肾上腺素的心血管作用的影响，掌握“肾上腺素作用的翻转”的概念及意义。
【实验原理】
肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素分别作用于相应/、或肾上腺素受体，产生心、血管效应。
此效应可被或受体阻断药所阻断。
酚妥拉明为受体阻断药，能阻断血管收缩有关的肾上腺素受体，而与血管舒张有关的肾上腺素受体未被阻断，可将肾上腺素的升压作用翻转为降压作用。
《设计提示》
现有未贴标签的3个肾上腺素受体激动药（肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素，0.5ml/kg，静脉注射），请用α受体阻断药0.1%甲磺酸酚妥拉明（0.5ml/kg，静脉注射）和β受体阻断药0.1%盐酸普萘洛尔（0.3ml/kg，静脉注射）作为工具药，自行设计给药方案和顺序，以鉴别这3个药各为何药。
【实验动物】
家兔，体重2.5~3kg
【药品与器材】
3%戊巴比妥钠溶液、肝素、0.1%甲磺酸酚妥拉明溶液、0.1%盐酸普萘洛尔溶液、生理盐水、0.001%A溶液、0.001%B溶液、0.002%C溶液
兔板、PowerLab系统、血压换能器、心电图导联线、止血钳×4、手术剪刀、眼科剪、动脉夹、动脉套管、注射器、丝线、线绳、纱布块
【实验步骤】
1．麻醉与固定
家兔称重，用3%戊巴比妥钠1ml/kg静脉注射麻醉，背位固定于手术台上。
2．手术
剪去颈部兔毛，在颈正中纵行切开皮肤，在气管一侧分离颈总动脉（3~4cm），丝线结扎远心端，动脉夹夹住近心端，在远心端结扎部位下方约0.3cm处剪一斜形小口，朝向心方向插入充满肝素溶液的动脉套管，用丝线结扎固定。
将动脉插管另一端接到血压换能器上，并连接到PowerLab主机第1通道上（channel1，显示BridgeAmplifier选项）。
放开动脉夹后，见波动扫描曲线。
3．电极连接
在家兔的右上肢、左右下肢末端皮下插入针状电极，II导联ECG连接：
家兔右上肢连接负极（NEG），左下肢连接正极（POS），右下肢连接地线。
将电极连接到生物电导线上并通过生物电放大器连接到PowerLab主机第5通道上（channel5，显示BioAmplifier选项）。
4．参数设置与观察
使用Chart软件，channel1选项为“血压”，channel5选项为“心电图”。
建议：
首先描记一段正常动脉血压、心电图曲线，缓慢注射所提供的0.001%Ａ药，或0.001%Ｂ药，或0.002%Ｃ药，按0.5ml/kg给药，观察动脉血压及心电图曲线的变化。
待血压恢复正常后，或注射0.1%甲磺酸酚妥拉明0.5ml/kg，或注射0.1%盐酸普萘洛尔0.5ml/kg。
10min后，再注射Ａ药，或Ｂ药，或Ｃ药0.5ml/kg，观察血压及心电图变化。
【注意事项】
（1）手术过程应尽量减少出血，以免引起血压降低。
（2）分离颈动脉时动作要轻柔谨慎，不可损伤神经组织。
【思考题】
1．请说明你的实验设计依据。
2．比较三种肾上腺素受体激动药对血压、心脏的作用特点。
给不同肾上腺素受体阻断药后，三种药物作用的变化有何不同？
实验三M胆碱受体系列实验之一
有机磷酸酯类中毒、解救及胆碱酯酶活性测定
【实验目的】
通过对有机磷酸酯类中毒的症状以及阿托品和解磷定的解救作用的观察，从整体水平和分子水平了解内源性神经递质-乙酰胆碱对M胆碱受体的作用。
【实验原理】
有机磷酸酯类通过难逆性抑制胆碱酯酶活性，使内源性递质乙酰胆碱在体内堆积，产生中毒症状，由于乙酰胆碱作用的广泛性，其症状表现多样化，轻者以M样症状为主，中度者可同时有M、N样症状，重度者还可出现中枢症状。
M受体阻断药阿托品能解除有机磷酸酯类中毒的M样症状，而胆碱酯酶复活药解磷定可复活胆碱酯酶，恢复其水解乙酰胆碱的能力，对M及N样症状均有效。
两者合用可提高解毒效果。
有机磷酸酯类中毒程度及胆碱酯酶复活药解救疗效亦可通过测定胆碱酯酶活性的变化来反映。
血及组织中胆碱酯酶使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被分解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活性。
【实验动物】
家兔，体重2.5～3.0kg。
【药品与器材】
0.5%硫酸阿托品溶液、2.5%碘解磷定溶液、1%敌敌畏溶液、胆碱酯酶测定药盒。
兔盒、注射器（1ml×4、2ml×3、10ml×1、抗凝试管×3、非抗凝试管×5、干棉球、酒精棉球、砂轮、小烧杯、250l加样器、加样器吸头、记号笔。
【实验步骤】
1．称重与观察
家兔称重，观察并记录活动情况、呼吸（频率，有无呼吸困难）、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力及有无肌震颤等。
2．正常血样采集
用酒精棉球擦试兔耳外缘静脉，当其充血明显时，用剪刀横断耳缘静脉使血液（0.5～1.0ml）自然流入试管（试管内预先滴入2滴肝素，自然干燥后备用）中，并轻轻地振荡试管，防止凝血。
供测正常胆碱酯酶活性。
3．动物中毒模型复制与血样采集
给兔肌肉注射1%敌敌畏0.6ml/kg，观察并记录中毒症状。
待中毒症状明显时，依上法采血供测中毒后胆碱酯酶活性。
然后，立即静脉注射阿托品0.3ml/kg和碘解磷定2.7ml/kg，观察并记录中毒症状有何变化，在症状改善明显时，再次采血，供测给解救药后胆碱酯酶活性。
4．胆碱酯酶活性测定
1）将以上试管内的血样离心（3500rps/min）10min，取血浆50l，测定胆碱酯酶活性。
2）取5支试管，按下列步骤加样（表6-1）：
表6-1胆碱酯酶活性测定加样顺序
测定管×3
对照管
空白管
血浆样品（ml）
0.05
－
－
蒸馏水（ml）
－
0.05
0.3
8mol/ml乙酰胆碱应用液（ml）
0.25
0.25
－
试剂一（ml）
0.5
0.5
0.5
混匀，37℃水浴20min
试剂三（ml）
1.0
1.0
1.0
试剂四（ml）
0.5
0.5
0.5
试剂五（ml）
0.25
0.25
0.25
试剂六（ml）
0.5
0.5
0.5
混匀，离心（3000～3500rps/min）10min，取上清，于520nm处比色，测定吸收度（A）。
①单位定义：
1ml血浆在37℃和底物作用20min，分解1mol乙酰胆碱为1U。
②计算公式：
（*标准品浓度为8mol/ml；**取样量为0.05ml。
）
【统计与处理】
以全班结果（CHE活性，U/ml）作配对t检验，检验敌敌畏中毒后与中毒前、用解救药物后与中毒时有无显著性差异。
【思考题】
1.测定胆碱酯酶活性有何意义？
2.从本实验结果分析乙酰胆碱的作用。
实验四M胆碱受体系列实验之二
M胆碱受体激动药和阻断药对大白鼠离体空肠的作用
【实验目的】
通过离体器官实验，观察药物对M胆碱受体的激动作用和竞争性拮抗作用，加深理解受体的亲和力、内在活性概念以及受体动力学参数KD、pD2、Emax及pA2的计算和意义。
【实验原理】
M胆碱受体激动药卡巴胆碱能剂量依赖性地激动肠管平滑肌上的M胆碱胆碱受体，产生平滑肌收缩效应，M胆碱受体阻断药阿托品可竞争性拮抗卡巴胆碱对M胆碱受体的激动作用。
通过累积剂量效应曲线，以及曲线直线化方法，可求得受体动力学常用参数。
【实验动物】
雄性大白鼠，体重300g左右。
【药品与器材】
卡巴胆碱（mol/L）：
10-6、10-5、10-4、10-3、10-2
阿托品（mol/L）：
310-7
Krebs液：
NaCl6.6g、无水CaCl20.28g、KCl0.35g、MgSO47H2O0.294g、KH2PO40.162g、NaHCO32.1g、葡萄糖2.0g，加蒸馏水至1000ml。
离体器官浴池及恒温装置、PowerLab系统、混合气体（95％O2＋5％CO2）、负荷500mg、加液器、培养皿、缝针、线、眼科镊子、剪刀。
【实验步骤】
1．离体肠肌的制备
猛击大白鼠头部至昏，立即剖开腹腔，自胃向下约20公分处开始剪取空肠一段，迅速置于Kreb's液中。
小心修去肠系膜，用吸管吸取Kreb's液缓慢冲洗肠内容物；将空肠段分割成2cm的小段备用，然后用缝针在肠段两端各穿一根线，作为固定肠肌之用。
2．实验装置
将制成的标本一端固定于通气钩上，另一端连接于肌力换能器并接入PowerLab系统的桥式放大器上，浴池内放20mlKreb's液，加500mg负荷，恒温371C，浴池内持续通入95％O2与5％CO2的混合气体。
3．累积剂量－效应曲线的制作
实验装置完毕以后，打开PowerLab系统，按“操作指南”设置参数：
（1）选择channel1
（2）记录速度10/s
（3）BridgeAmplifer中“rang”选择20mv，“LowPass”选择50Hz
（4）调零“zero”
描记肠肌收缩曲线，待收缩基线平稳后，按下列（表6-2）次序在浴池中加入预先配好的不同克分子浓度的卡巴胆碱。
表6-2累积剂量法加药顺序
累加次序
药液浓度（mol/L）
药液的毫升数（ml）
每L中累积剂量
（mol）
1
10-6
0.2
0.01
2
10-6
0.4
0.03
3
10-5
0.14
0.1
4
10-5
0.4
0.3
5
10-4
0.14
1
6
10-4
0.4
3
7
10-3
0.14
10
8
10-3
0.4
30
9
10-2
0.14
100
10
10-2
0.4
300
随药液的依次加入，浴池内药物浓度不断提高。
每加入一个剂量后，约经数秒钟肠肌的收缩达高峰。
应在高峰未下降前，迅速加入下一个剂量。
当反应到一定高峰，再递增剂量，效应不再增加，此时的效应为最大效应。
4．阿托品拮抗卡巴胆碱的剂量－效应曲线的制作
放去浴池中的液体，用Kreb's液冲洗三次，以后每隔10min冲洗一次，共冲洗三次，再加入Kreb's液至20ml。
待收缩基线平稳后，加入阿托品10－7mol/L0.6ml（实际浓度3×10-9mol/L），孵育15min，再按“方法3”依次加入不同浓度的氨甲酰胆碱，便可得到有拮抗剂时氨甲酰胆碱的累积剂量效应曲线，此时拮抗剂（阿托品）摩尔浓度的负对数即pAx。
【统计与处理】
1．绘制累积剂量效应曲线
取方格纸，以肠肌收缩幅度（mv）作为纵坐标即效应（E），以药物对数浓度（lgC）为横坐标，绘制量效曲线。
KD值即达到50％最大效应时，在横坐标上所对应的药物浓度。
药物的最大效应（Emax）即曲线的高度。
当比较同类药物的Emax时，即比较曲线的高度（肠肌收缩最大幅度）。
2．直线回归（LR）计算参数
为了正确求得各参数，必须将曲线直线化。
可按D/R式（改良Lineweaver－Burk式）使剂量效应曲线直线化。
（y）（a）（b）（x）
式中：
D为药物剂量（浓度），E为某一剂量的效应，KD为药物的解离常数，Emax为药物的最大效应。
以[D]/E为纵坐标，[D]为横坐标进行直线回归。
按直线公式y=a+bx，则
－LogKD即pD2
根据公式pA2=pAx+log（x-1），式中pAx为拮抗剂摩尔浓度的负对数，x为用拮抗剂后与用拮抗剂前KD之比。
附1：
KD、pD2、Emax和pA2的意义：
（1）KD值与效价强度（potency）：
药物与受体结合的能力为亲和力（affinity），常以1/KD代表。
KD为药物受体相互作用当反应达到平衡时的解离常数，KD也是使50％受体成结合受体的药物浓度，KD值越大，则药物和受体的亲和力越小。
药物和受体结合后，通过一系列生化反应最后产生效应（如肠肌收缩）；达到一定效应的相应剂量叫做药物作用的效价强度。
药物受体结合，所产生的效应和剂量成线性关系时，其KD值即1/2Emax时的药物浓度[D]，亦即效价强度。
（2）pD2：
为激动剂产生最大反应的50％（1/2Emax）的摩尔浓度负对数，即KD的负对数，所以pD2=－LogKD。
pD2代表激动剂的亲和力。
（3）最大效应（Emax）和内在活性：
Emax可代表药物的内在活性或效能（efficacy），不同药物作用于同一受体，即使加大剂量，其Emax值大小不同，可比较其内在活性（）大小，完全激动剂=1，部分激动剂0<<1，而竞争性拮抗剂=0。
（4）pA2：
为拮抗指数，代表竞争性拮抗剂对其受体的亲和力，pA2值越大，拮抗效力越大，与pD2的含义相似，P是指数之意，A是拮抗剂（Antagonist）的首字母。
由于拮抗剂本身无效应力，故无法直接求拮抗剂的解离常数KA，必须借助于激动剂显示其效力大小。
pA2值是使激动剂量效曲线平行右移2倍时，所需竞争性拮抗剂的摩尔浓度的负对数（平行右移2倍意即在用拮抗剂后，产生同样反应所需激动剂的剂量比例为2）。
pAx反映拮抗药的拮抗效能，表示在[B]浓度的拮抗药存在时，激动剂需要加大X倍浓度才能达到未加拮抗药的效应。
【注意事项】
（1）悬挂肠管时，不要过度牵拉肠管，肠管及连线勿紧贴浴管壁。
（2）加药时不要将药液滴在连线上，应直接滴在液面上。
（3）水浴箱应保持在371C，浴池内营养液的容积在洗涤标本前后要保持一致。
（4）为了正确地制作累积剂量反应曲线，应在对某剂量的反应到最大后立即给予下一个剂量，但若前一个剂量达到最大反应后慢慢观察再加下一个剂量，则反应曲线难予累积，故可稍微提前一点加入下一个剂量。
【思考题】
1．与整体实验比较，离体实验有何优点？
2．简述量效曲线的特征以及受体动力学参数KD、pD2、Emax、pA2的意义。
实验五M胆碱受体系列实验之三
【实验目的】
了解M胆碱受体亚型分析的常规方法。
【实验原理】
受体亚型分析是受体药理学研究热点。
根据所采用技术方法的不同，M受体有两种分型：
分子生物学分型和药理学分型。
分子生物学分型则根据M受体基因编码五种受体蛋白质，分别表示为m1、m2、m3、m4、m5。
药理学分型是根据各拮抗剂对不同受体亚型具有不同的亲和力来进行区分的，包括M1、M2、M3、M4四型，分别对应于分子生物学分型m1、m2、m3、m4，尚未找到与m5相对应的药理学分型。
采用分子克隆技术，分别将人的m1～m5五种亚型的cDNA插入表达载体，并转导至本身不表达或少表达M受体的细胞（如中国仓鼠卵巢细胞，CHO细胞）中，形成仅表达一种M受体亚型的细胞株，然后，用受体放射配基结合试验和受体后信使或功能变化来研究M受体亚型选择性的药物。
另外，采用富含不同M受体亚型的组织，结合亚型特异性M胆碱受体阻断药区分受体亚型仍是常规方法。
例如豚鼠回肠平滑肌富含M３受体，心房富含M２受体，而大鼠上颈交感神经节、家兔的输精管富含M1亚型受体。
以M１受体分型为例，用M受体激动药刺激神经标本可记录到神经标本的动作电位。
用不同M1、M2亚型的特异性的阻断药pirenzepine和gallamine作用于标本后，再观察M受体激动药引起动作电位的变化，可用于区分M１受体的亚型介导作用。
组织水平的受体分型条件要求相对不高材料易于获得，结果重复性好。
相对于采用转人受体基因的细胞而言，可观察到受体相互作用。
【实验动物】
大鼠，体重150~250g。
【药品与器材】
M受体激动药：
carbachol（1M）；
M1受体阻断药：
pirenzepine（300nM~1M）；
M2受体阻断药：
gallamine（10M）；
M受体阻断药：
atropine：
30M。
CaCl2（0.1mM）
缓冲液（mM）：
NaCl125；KCl5；KH2PO41；CaCl22.5；MgSO41；NaHCO25；葡萄糖10。
PowerLab系统、三腔室离体标本盒、解剖器械一套、手术剪刀、眼科镊子、止血钳、棉花签。
【实验步骤】
1．手术与分离标本
（1）猛击大鼠胸部至其昏迷，切开颈部皮肤，分离出上颈交感神经节，并取出置于充满缓冲液的表面皿中。
（2）用棉签轻轻地擦一下神经标本，以去除神经鞘。
之后立即将标本浸入标本盒（标本盒内充满营养液，并持续通入95％O2~5％CO2混合气体，标本盒恒温25C）。
离体神经主干置于标本盒中央室。
2．连接装置
接通PowerLab系统，进行仪器的定标：
0.2mv/10min。
记录无刺激时神经动作电位。
3．观察与记录
（1）用M受体激动药carbachol（1M）刺激神经标本1min，使神经标本极化，并记录之。
（2）用M受体激动药之后，间隔10min给予M1受体阻断药pirenzepine（300nM~1M），孵育30min后重
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