绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文.docx
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绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文
绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文
1.前言
二酰基甘油酰基转移酶（DGAT,包括DGAT1、DGAT2和DGAT3）是参与肠道中脂肪吸收、脂蛋白组装、血浆甘油三脂（TG）浓度调节、脂肪细胞中脂肪储存、肌肉能量代谢[1]及乳脂合成、禽蛋及卵母细胞形成等的一种非常重要的微粒体限速酶。
据报道[2-4],Dgat-deficient（Dgat-/-）小鼠尽管能存活,但比普通小鼠瘦弱,它可通过增加能量消耗对食物特别是高脂肪饮食诱导的肥胖症产生抗性,其组织TG水平降低,胰岛素和瘦素敏感性以及葡萄糖耐量提高,而且母鼠不能泌乳,因此DGAT基因可能是影响动物生长发育及胴体性状的重要候选基因。
此外,过表达DGAT1（二酰基甘油酰基转移酶1）可减少信号脂质（二酰基甘油、磷脂酶等）而合成TG,调节膜脂质和信号脂质的合成,因而在调节细胞生长方面有重要作用[5]。
有研究表明,牛DGAT1基因的一个K232A变异位点与产奶性状尤其是乳脂率密切相关,该突变可能就是该14号染色体上影响乳脂率的QTL（数量性状基因座）效应的分子机制[6-9]。
目前大多研究者认为,DGAT1基因是影响牛奶乳脂率及脂肪沉积的重要候选基因,在生长发育和肉质性状等的形成中具有重要的生物学功能。
在羊上，主要的研究集中于羊的脂肪沉积和DGAT1基因的活性表达和DGAT1基因的分离鉴定表达与调控的研究是热点。
大多数都采用SSCP。
RFLP,RAPD等方法分析该基因的多态性，再筛选优势基因进行研究，然后进行定向诱变，加大优势基因的突变频率，产量可大幅提高。
2.实验材料与器材
2.1实验材料
本试验所用的样品为绵羊的全血，样本数量为4份，采取颈静脉采血，用肝素钠抗凝后，采样后立即编号，迅速做DNA的提取。
2.2主要仪器和设备
（1）凝胶数字成像系统：
Bio-Pro型，西盟国际公司，00608124
（2）电泳仪：
北京六一仪器厂（DYY-1L）,Biometra公司（２xT5AH）
（3）电泳槽：
Biometra公司
（4）PCR仪：
Biometra公司
（5）微型离心机：
Thermo公司
（6）电热恒温水浴锅：
DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司
（7）多功能水域恒温振荡器：
SHA-D型，江苏正基仪器有限公司
（8）旋涡混合仪：
XW-80A型，海门市其林具而仪器制造有限公司
（9）立式电热压力蒸汽灭菌锅:
LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂
（10）制冰机：
SIM-F140型，SANYO公司
（11）超纯水设备：
Sartorius公司
（12）可调式微量移液器：
Thermo公司，编号和量程如下表：
表1试验所用的微量移液器
编号
ZX01518
ZX00732
ZX03315
ZX05185
量程（μL）
0.5-10
5-50
20-200
100-1000
2.3分子生物学与制图软件
（1）DNASTARLastergene（转换序列和查找序列）
（2）PrimerPremier5.0（引物设计）
（3）Oligo（验证引物合理性）
２.４主要试剂
（1）ＤＮＡ提取试剂盒:
H.Q.&.QDNA提取试剂盒，安徽优晶生物工程有限公司生产，组成Mu-PuDNA分离柱，2ml收集管，ZZ-I缓冲液，ZZ-II缓冲液，DNA洗涤缓冲液，DNA洗脱缓冲液，OB蛋白酶。
（2）PCR试剂盒：
Fermentas公司生产
试剂盒的组成：
25mmol/L10×TaqBuffer,10mmol/LdNTP,5U/μLTaqPolymerase,25mmol/LMgCl2。
（3）其他试剂：
琼脂糖、鹏程生物批号：
Ameresco0425
600bpladderMaker、上海生工生物工程有限公司批号：
HF405
6×loadingbuffer鹏程生物批号：
Ameresco0463、
Tris碱鹏程生物批号：
Ameresco0497、
过硫酸铵莱阳市双双化工有限公司批号：
2007.01.0924、
丙烯酰胺、西安化学试剂厂批号：
GBG75-52
去离子甲酰胺Bio.Basic.ing公司批号：
FDB0212-500ml、
硝酸银西安化学试剂厂批号：
GBG70-77、
无水碳酸钠天津正太龙化工有限公司批号：
070410、
无水乙醇烟台双双化工有限公司批号：
2008.3.28、
TE缓冲液上海生工生物工程有限公司批号：
SD106、
甲醛上海中秦化学试剂有限公司批号：
2007.4.3
硼酸天津巴斯夫化工有限公司批号：
06.11.08
3.实验设计与方法
3.1实验设计
本实验总体思路：
采样→进行DNA提取→对提取的DNA进行PCR→琼脂糖电泳检测扩增产物的特异性→PAGE检测样品基因的多态性
3.2试验方法
3.2.1基因组DNA的提取
本实验采用DNA提取试剂盒来提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。
（1）取1ml抗凝血，移入1.5ml离心管中，加入200μLZZ-I缓冲液。
（2）加入25μL20mg/ml的OB蛋白酶，漩涡混匀后，55℃温浴3h,每30min在旋涡混合仪上混匀一次。
（3）温浴3h后，104g/min离心1分,将上清液转移到1.5ml离心管中。
（4）在上清液中加入220μLZZ-II缓冲液,旋涡混合仪上混合均匀,70℃水浴10min。
（5）加入220μL无水乙醇,旋涡混合仪上混合均匀。
（6）所的样品转移至Mu-Pu柱上,将柱放入2ml收集管中,8000g/min离心1min。
弃去收集管中的液体。
（7）把柱子装到新的收集管中,吸取720μL用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中，8000g/min离心1min,弃去收集管。
（8）把柱子装到新的收集管中,吸取720μL用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中，8000g/min离心1min,弃去收集管。
（9）急速离心（104g/min以上）2min,甩干DNA。
（10）将柱子置于1.5ml离心管中,加入200μL70℃预热的DNA洗脱缓冲液,室温放置3min。
（11）8000g/min离心1min以从柱子上洗脱出DNA,收集管中的液体即为DNA溶解液。
（12）DNA的检测:
吸取5μL从柱子上洗脱出的DNA,与1μL6×loadingBuffer混合好后,点样于1.0%的琼脂糖凝胶上,100V恒压电泳0.5-1h,电泳结束后于凝胶成像系统上观察条带,并判断所提取的基因组DNA能否用于PCR扩增反应。
3.2.2引物的设计与合成
引物根据GeneBank上发表的绵羊的DGAT1基因部分序列，利用DNASTAR软件转换成SEQ格式的文件，再用PrimerPremier5.0软件设计合理的引物，并经oligo软件和blast工具进行验证后，提交上海捷瑞生物工程公司合成引物。
（引物见附录）
3.2.3PCR扩增反应
1.PCR扩增反应体系
本实验采用25μLPCR反应体系,各组分体积、浓度如表2所示
表225μLPCR反应体系
PCR反应各组分
所用体积（μL）
终浓度
25mmol/L10×TaqBuffer
2.5
2.5mmol/L
0.5U/μLTaqDNAPolymerase
0.2
0.04U/L
2.5mmol/LMgCl2
2.0
0.2mmol/L
PCR反应各组分
所用体积（μL）
终浓度
2.5m/LdNTPs
2.5
1mmol/L
DNA模板
1.5
0.05g/l
10μmol/L上游引物
1.0
0.4μmol/L
10μmol/L下游引物
1.0
0.4μmol/L
超纯水
14.3
--
2.PCR扩增程序
本次采取普通PCR来扩增目的DNA，PCR扩增程序如下：
表3PCR扩增过程表
温度（℃）
时间（s）
过程
备注
95
5
预变性
--
94
45
变性
循环35次
61
60
退火
72
60
延伸
72
600
延伸
充分合成产物
4
7200
保存
如需立即实验，则不用此步
3.PCR扩增产物的检测
从每个反应管中分别取3μL扩增产物，与1.0μL6×LoadingBuffer混匀，加样于1%的琼脂糖凝胶上，另加5μL600bpDNAMarker做参照。
100V电泳0.5h。
结束后，于凝胶成像系统上观察条带，特异性很好的PCR产物方可用于PCR-SSCP检测，无条带或是非特异性条带产物出现的产物都不能用于PCR-SSCP。
3.2.5PCR-SSCP检测（聚丙烯酰胺凝胶电泳）
3.2.5.1电泳装置的准备
在方盒中装上水,并加入一定量的洗涤剂,再将所用的玻璃板放入,浸泡0.5-1h,之后用软毛刷将其表面的污渍去除干净,再用自来水冲至无泡沫,用蒸馏水冲洗3-5次,再用75%的酒精擦拭使用面（也可全擦）,待干燥后将垫条夹在玻璃板中间,外面用透明的胶布粘贴（每个面上卷回0.8cm即可）,再用夹子固定于胶版架上,防止倒胶时外漏。
3.2.5.2聚丙烯酰胺的制备
1凝胶贮存液的制备
（1）超纯水:
用超纯水设备制备电阻率超过10MΩ·cm-3超纯水100ml，存放于4℃，备用。
（2）30%丙烯酰胺贮存液：
称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶于60ml上述的水中（必要时加热至37℃），再定容至100ml，存放于4℃，备用。
（3）10%过硫酸铵称取3g过硫酸铵（A.R.）溶于30ml水中，存放于4℃，备用。
（4）TEMED（四甲基乙二胺）新买来的TEMED，需分装成小包装使用，一般分成2ml/份。
（5）5×TBE称取54gTris,3.72gNa2EDTA·2H2O,27.5g硼酸（H3BO3）,混合加入1L的烧杯内,并加入800ml的去离子水,充分搅拌至完全溶解,再加水定容至1L,室温存放。
2.PAG凝胶的制作
本实验采用8%的凝胶电泳,具体配方见下表[10]:
表48%的PAGE配方表
--
15
20
25
30
40
50
80
作用
超纯水
7.9
10.5
13.2
15.8
21.1
26.4
42.2
稀释
30%丙烯酰胺贮存液
1.0
5.3
6.7
8.0
10.6
13.3
21.3
凝胶的成分
5×TBE
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
16.0
加大离子强度
10%过硫酸铵
0.11
0.14
0.18
0.21
0.28
0.35
0.56
引发剂
TEMED
0.010
0.013
0.016
0.020
0.026
0.033
0.052
加速剂
3.聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）将夹住的玻璃板于桌面呈70°放置，将混匀的凝胶液缓慢倒入两块玻璃板中间，直至灌满，注意此操作不可产生气泡。
（2）灌好后立即插入梳子，梳子底端不要产生气泡，须仔细观察
（3）在室温下聚合约30-40min，梳子底端的凝胶出现折射率不同的线，表明凝胶聚合完成，拔去梳子。
（4）立即用电泳缓冲液冲洗加样孔，冲走多余的未聚合的凝胶。
（5）拆除胶带和垫条将加样孔朝向电泳缓冲液的槽放置，并用夹子固定。
（6）在上下两槽中倒入1×TBE缓冲液，并检查上槽是否漏液。
（7）将电泳槽的盖子盖上，并查到电泳仪上，开始预电泳，电压150V，时间：
半小时。
3.2.5.3PCR产物的处理
在PCR管内加入4μL去离子甲酰胺和1.5μL6×loadingBuf
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