新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程doc.docx
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新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程doc
新城疫冻干疫苗生产工艺流程
1生产用毒种制备
1.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,尿囊腔内接种
10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。
选接种后72~120小时死亡、且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水）,装于灭菌容器内。
将检验无菌、且对1%鸡红细胞凝集价≥1:
640（微量法1:
512）的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存。
注明收获日期,毒种代数等。
1.2
毒种鉴定
1.2.1
病毒含量
按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为
10倍系列稀释，取
10-7、
10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃
继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，
收获鸡胚液，同一稀释度
的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚,
逐个收获
鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:
160（微量法1:
128）者判为感染，计
算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。
1.2.2纯净应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，分别按《无菌检验或纯
粹检验标准操作规程》、《支原体检验标准操作规程》、《外源病毒检验标准操作规
程》进行。
1.3毒种保存在-15℃以下保存,应不超过1年。
1.4毒种继代应不超过3代。
2制苗材料选择选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚作为制苗材料。
3制苗用毒液的制备
3.1接种取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,每胚尿囊腔
内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36~37℃继续孵育，不必翻蛋。
3.2孵育和观察鸡胚接种后,每日照蛋一次，将在60小时前死亡的鸡胚弃去。
60小时后,每4~8小时照蛋一次,死亡的鸡胚随时取出,直至96或120小时,不论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2~8℃冷却。
3.3收获将冷却4~24小时的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术
剥除气室部卵壳，剪开尿囊膜，吸鸡胚液,每若干个鸡胚的胚液混合为一组。
收获
后的胚液置于灭菌瓶中，作好标识，留样后，结冻保存。
在收获胚液的同时,应逐个检查鸡胚,如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染
可疑者弃去不用。
4半成品检验
4.1无菌检验经处理过的胚液,每组分别取样,按《无菌检验或纯粹检验标准操
作规程》进行无菌检验,应无细菌生长。
4.2病毒含量测定
按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释
度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小
时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，
同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取
出所有活胚,逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:
160（微量法
1:
128）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量>107EID50者可用于配制疫苗。
5配苗及分装
将检验合格的若干组鸡胚液滤过,混合于同一容器内,按规定羽份,加一定比例
的蔗糖脱脂奶粉作稳定剂,使其最终蔗糖含量为2.5%，脱脂奶粉含量为5%，同时
加入适宜的抗生素,充分摇匀,定量分装,每羽份病毒含量应≥106EID50。
分装后迅速
进行冷冻真空干燥。
6成品检验
6.1物理性状
6.1.1外观检查疫苗瓶上的标签，打印出的羽份或头份、生产批号、有效日期
清晰可见、位置适当。
瓶上的铝盖稳固不松动。
6.1.2眼观检查将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色，海绵状疏松团块，然
后再轻微振动，疫苗松动并与瓶壁分离，判为合格。
6.1.3溶解性检查用稀释液注射到疫苗瓶内，经轻微振动，疫苗应迅速完全溶
解，无粘块或粘团出现，判为溶解性良好。
6.2无菌检验按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行，如有菌生长，应
进行杂菌计数，并作病原性鉴定（按《杂菌计数和病原性鉴定操作细则》进行）
和禽沙门氏菌检验每羽份非病原菌数应不超过1个（按《禽沙门氏菌检验法》进
行）。
6.3支原体检验按《支原体检验法》进行，应无支原体生长。
6.4
鉴别检验
6.4.1
选择发育良好的
10日龄SPF鸡胚10只，划出尿囊腔接种部位。
6.4.2
将疫苗用无菌生理盐水稀释至
105.0EID50/0.1mL，与等量抗鸡新城疫病毒特
异性血清混合，室温中和
1小时后，尿囊腔接种，每胚0.1mL。
6.4.3将接种后鸡胚用石蜡封孔后，置37℃继续孵育，观察120小时，在24~120
小时内应不引起特异死亡，且至少存活8只，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴
性。
6.5外源病毒检验按《外源病毒检验法》进行。
6.6安全检验下列方法任择其一。
6.6.1用鸡胚检验将疫苗用无菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种10日龄鸡胚10
只，每胚0.1ml（含10个使用剂量），接种后24~72小时，鸡胚死亡率应不超过20%为合格。
如死亡率超过20%，可用20个鸡胚重检1次，重检结果死亡率仍超过20%，该批疫苗判为不合格。
6.6.2鼻接种
用鸡检验用2~7日龄SPF雏鸡20只，合成两组，第1组10只，每只滴
0.05mL（10个使用剂量）；第2组10只，不接种作为对照，两组在相同条
件下分别饲养管理，观察10日，应无不良反应。
如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不超过1只。
6.7效力检验下列方法任择其一。
6.7.1用鸡胚检验
6.7.1.1
鸡胚选择
选择发育良好的
10日龄SPF鸡胚15个，划出尿囊腔接种部
位，作出批组及滴度标记，每一滴度接种
5个。
6.7.1.2
疫苗稀释
将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释至
1羽份
/0.1mL，再作10倍系列稀释至10-7。
6.7.1.3
接种分别取10-7、10-6、10-5三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各
5个，每
胚0.1mL，用石蜡封孔。
6.7.1.4
孵育置37℃继续孵育至120小时，每天上、下午各照检
1次，48小
时以前死亡的鸡胚弃去不计，在
48~120小时死亡的鸡胚，随时取出放在2~8℃冰
箱中，至
120小时取出全部活胚放在2~8℃℃冰箱中
24小时。
6.7.1.5
凝集价（HA）测定与计算鸡胚半数感染量（
EID50）将冷却鸡胚取出，
将同一稀释度的死亡鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价；将活胚逐个收获鸡胚液，分别测定红
细胞凝集价，HA≥160（微量法128）者判为感染，计算半数感染量，每羽份
≥106.5EID50（国家标准每羽份≥106.0EID50），判为合格。
6.7.2用鸡检验
6.7.2.1鸡的选择选取30-60日龄健康易感鸡（血凝集抑制价应≤
4）10只。
6.7.2.2疫苗稀释
将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释成每
0.05mL
含
1/100
使用剂量。
6.7.2.3免疫及攻毒
每只鸡滴鼻接种
0.05mL，10~14日后，连同条件相同的对
照鸡3只，各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒104.0ELD50，观察10-14
部发病死亡，免疫鸡至少保护9只为合格。
6.8剩余水分测定按《剩余水分测定方法》进行，应符合规定。
日，对照鸡全
6.9真空度测定按《真空度测定方法》进行，应符合规定。
鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目
种蛋消毒
*SPF
种胚
种蛋选择
前孵化
新城疫灭活疫苗生产工艺流程
1
生产用毒种制备
接种途径
1.1
毒种繁殖
*接种
10
-4
-5
），尿囊腔内
将毒种用灭活生理盐水作适当稀释（如
或10
照蛋时间
接种剂量
无菌检验
接种
*后孵化及照蛋
。
选接种后
72～120
小时之间死亡且病痕明显
10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml
培养温湿度
病毒含量
的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水）
，装于灭菌容器内。
将检验无菌，且对
冷蛋时间
*冷蛋
收
获
-15℃冷冻保存
冷蛋温度
1：
512）以上的鸡胚液混合，定量分装于安
1%鸡红细胞凝集价在1：
640（微量法
铝盖
分装瓶
保护剂
胶
瓿瓶中，冷冻保存。
注明收获日期、毒种代次等。
1.2
毒种鉴定
纯化水粗洗
配
苗
无菌检验
粗洗
清洗
1.2.1
病毒含量
按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为
10倍系列稀释，取10-7、
*灭菌
-9
注射水洗
分装前、中、后无检
纯化水洗
-8
10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃
10
、103个稀释度各尿囊腔内接种
继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，
*隧道烘箱灭
分
装
*脉动蒸汽灭菌
收获鸡胚液，同一稀释度
加
塞
干燥
的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至
120小时，取出所有活胚,
逐个收获
冻
干
物理性状
鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:
160（微量法1:
128）者判为感染，计
出箱
安全检验
无菌检验压盖
外源病毒检验
贴
签
抽
样
装箱入库
算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。
1.3
毒种保存
在-15℃以下保存，应不超过6个月。
1.4
毒种继代
应不超过3代。
2
制苗材料选择
选择发育良好
9～10日龄的易感鸡胚作为制苗材料。
3制苗用毒液的制备
3.1
接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如
10-4或10-5），每胚尿
囊内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。
3.2
孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。
此
后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至
96小时，不论死亡与否，
全部取出，气室向上直立，置于
2～8℃冷却4～24小时。
3.3
收获
3.3.1
鸡胚液的收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手
术破除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（谨防卵黄破裂），吸取
胚液。
对每个鸡胚在
吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不
用。
死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容
器内，每组抽样测定血凝价，血凝价低于1：
160（微量法1：
128）者应弃去。
同
时作无菌检查，应无细菌生长。
收获的胚液灭活前在2～8℃左右保存，应不超过
5日。
3.3.2鸡胚胎儿收获及浸出液的制备在收获及胚液的同时，取病变胎儿，去头、
脚，用生理盐水洗2～3次，磨碎，制成（1：
5）～（1：
10）乳剂，加适宜的抗
生素适量，然后离心或以4层纱布一层铜纱网滤过，置自然沉淀1～2日，然后取
样作无菌检查。
以上清夜作为配制双相油乳剂疫苗用。
4灭活将上述无菌胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价。
其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入10%甲醛溶液，
随加随摇，使其能充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1%。
加甲醛溶液后最好倾
倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接触灭活剂。
然后在
37℃灭活16
小时（以瓶内温度达到37℃开始计时）。
期间振摇3～4次。
在2～8℃保存，应不
超过1个月。
5半成品检验
5.1
无菌检验取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附录
448进行，应无菌生长。
5.2
灭活检验
取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚
6个，每个接种灭活胚液
0.23ml，每日照蛋
2次，观察5日，鸡胚非特异死亡不应超过
1个。
对所有胚液
分别测定血凝价，应不出现血凝，认为灭活完全。
如有可疑，应将可疑胚液进行
重检，重检不合格者报废。
鸡胚浸出液也按照上述方法检查。
5.3毒价测定
将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个
稀释度分别接种
9～10日龄无鸡新城疫病毒抗体的鸡胚
5个，每胚尿囊内0.1ml，
每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价〉
1：
80（微
量法1：
64）以上者，判为感染，计算EID,每0.1ml
病毒含量≥10
8
EID,方可用
50
50
于制苗。
6单相油乳剂灭活疫苗制备
6.1油相制备取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2
份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
6.2水相制备取吐温-804份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加灭活胚液
96份，充分振瑶使吐温-80完全溶解为止。
6.3乳化取油相3份放于乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水
相1份，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶
液，使其最终浓度为0.01%。
乳化后，取3～5ml以3000r/min离心15分钟，若有
分层现，应重复搅拌1次。
7双相油乳剂疫苗制备
7.1用乳化罐乳化
7.1.1水相、油相制备同单相苗，但水相制备中，鸡胚液是按4%加入吐温，而鸡
胚浸出液则按6%加吐温。
7.1.2取油相2份放入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入胚液
1
份，加完后再以10000r/min搅拌。
7.1.3取鸡胚浸出液（单相苗鸡胚液等量）放于乳化罐，开动电机缓缓加入上述
油包水单相苗，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1%硫
柳汞溶液，使最终浓度为0.01.%。
乳化后取3～5ml以3000r/min离心10分钟，
若分层严重应再搅拌1次。
7.2用乳化罐乳化。
8分装定量分装，加盖密封。
9成品检验
9.1物理性状
9.1.1外观为乳白色乳剂。
9.1.2剂型单相苗为油包水型。
取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应
呈油滴状不扩散。
双相苗为水包油包水型，滴于冷水中，应呈云雾状扩散。
9.1.3
稳定性
在37℃左右条件下放置21日，应不破乳。
9.1.4
粘度
用1ml吸管（出口内径1.2mm），吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂
直自然流出，记录流出0.4ml所需时间。
单相苗在8秒以内，双相苗在
5秒以内
为合格。
9.2
无菌检验
按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》
进行，应无菌生长。
9.3
安全检验
用30～60日龄健康易感鸡（HI抗体≤1：
4）6只，各肌肉或颈
部皮下注射疫苗
1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反
应。
9.4
效力检验
用30～60日龄健康易感鸡（HI抗体≤1：
4）15只，其中10只
各皮下或肌肉注射疫苗20μl（用0.5ml
以下的注射器注射），另5只不免疫作对
照，21～28日后，连同条件相同的对照鸡
5只，各肌肉注射
5
10ELD强毒，观察
50
14日，对照组全部死亡，免疫组至少保护
7只为合格。
9.5甲醛含量测定按《甲醛含量测定法》进行，应符合《制品检验的有关规定》。
鸡新城疫灭活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目
*
种蛋消毒
非免疫种蛋
前孵化
种蛋选择
无相应抗体
附录
1.剩余水份测定法
接种途径
1
*接种
技术依据及原理
接种剂量
无菌检验
照蛋时间
*后孵化及照蛋
灭活检验
培养温湿度
卡氏法是利用卡氏试剂中的碘和二氧化硫在砒啶和甲醇溶液中能与水起定量
毒价测定
冷蛋时反应的原理，从而测定水份。
间
*冷蛋
收获
*灭活
-15℃冷冻保存
冷蛋温度
材料、仪器、试剂的准备及基本要求
2
铝盖
分装瓶
胶塞
2.1
仪器及设备
*油相制
*水相制
清洗
清洗
清
洗
*乳化
*灭菌分装前、中、后无检*脉动蒸汽灭菌
电子分析天平（精度0.1mg，称量范围0～110g），费休水份滴定仪（梅特勒
DL31）。
2.2试剂
卡氏试剂、无水甲醇，纯水。
2.3检验器具
止血钳（开启苗瓶），玻璃棒（或能捣碎检品的器具），10ul注射器，烧杯。
2.4样品每批疫苗4个样品。
2.5其它检验记录纸、笔、纱布和汗布手套。
3检验步骤
3.1接通电源、打开费休水份滴定仪（梅特勒DL31）主机、打印机、天平开关。
3.2按滴定仪的RUN键滴定仪自动滴定至终点。
3.3滴定仪屏幕显示待机模式Drift值在25以下指示箭头稳定→（平指）时，开
始滴定标定滴度：
3.3.1
按F2键至显示屏出现H2OISO3696
3.3.2
连续按F3键至显示屏出现pleaseaddsample0.0100g
3.3.3
天平去皮，通过进样孔注入已称重的纯水，
（用10μl注射器抽取10μl
纯水置天平称重）注射器放回天平后按F3;
3.3.4按F1自动输入样品量；
3.3.5按F2显示样品重量；
3.3.6按F3确认样品重量；
3.3.7滴定至终点自动打印出结果，打印结束按F3返回到待机模式；
3.3.8重复标定只需依上述第1条开始同法操作。
3.4
水份测定：
3.4.1
将样品置天平称重
3.4.2
连续按F3键，显示屏出现pleaseaddsample0.0000g
～5.000g;
3.4.3
天平去皮后通过进样口将已称重的样品加入滴定杯中，将载样杯放回天
平。
3.4.4
按F3
预滴定
3.4.5
按F1
自动输入样品量
3.4.6
按F2
显示样品重量
3.4.7
按F3
确认样品重量
3.4.8滴定至终点自动打印出结果，打印结束，按F3返回到待机模式
3.4.9
4记录与计算
5结果判定
每瓶样品含水量不得超过4.0％，如有超过时，可重检一次。
2.真空度测定法
1技术依据及原理
依据《兽用生物制品质量标准》附录中的真空度测定法，即使用高频火花真空
测定器测定。
它的基本原理是利用本仪器振动形成火花束，激励谐振荡回路，使
次线线圈感应出高频高压脉冲电压，使被检物产生不同颜色的辉光，根据颜色的
变化来判断疫苗的真空度。
2注意事项
2.1按照规定要求，在检验过程中至少要有一名检验员和一名复核员共同进行，
确保检验结果的准确性。
2.2检验要在光线较暗的操作室里进行，便于结果判定的准确性。
2.3被检样品从冷库中取出应擦干瓶壁上的水份，样品达到室温后再进行测定。
3材料、仪器、试剂的准备及基本要求
3.1
仪器及设备
电火花真空检测器。
3.2
升级会员 