新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程doc.docx

1、新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程doc新 城 疫 冻 干 疫 苗 生 产 工 艺 流 程1生产用毒种制备1.1 毒种繁殖 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-4 或 10-5 ), 尿囊腔内接种10 日龄 SPF鸡胚 , 每胚 0.1ml 。选接种后 72120 小时死亡、且病痕明显的鸡胚 , 分别收获鸡胚液 ( 尿囊液及羊水 ), 装于灭菌容器内。 将检验无菌、 且对 1%鸡红细胞凝集价 1:640( 微量法 1:512) 的鸡胚液混合 , 定量分装于安瓿中 , 冷冻保存。注明收获日期 , 毒种代数等。1.2毒种鉴定1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10 倍系列

2、稀释，取10-7 、10-8 、10-9 3 个稀释度各尿囊腔内接种 10 日 SPF鸡胚 5 个，每胚 0.1ml ，置 3637继续孵育，48 小时以前死亡的鸡胚弃去不计， 在 48120 小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至 120 小时，取出所有活胚 ,逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价 1:160 ( 微量法 1:128) 者判为感染，计算 EID50，每 0.1ml 病毒含量应 10 8EID50。1.2.2 纯净 应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，分别按 无菌检验或纯粹检验标准操作规程 、支原体检验标准操作规

3、程 、外源病毒检验标准操作规程进行。1.3 毒种保存 在 - 15以下保存 , 应不超过 1 年。1.4 毒种继代 应不超过 3 代。2 制苗材料选择 选择发育良好的 911 日龄 SPF鸡胚作为制苗材料。3制苗用毒液的制备3.1 接种 取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 ( 如 10-4 或 10-5 ), 每胚尿囊腔内接种 0.1ml ，接种后密封针孔，置 3637继续孵育，不必翻蛋。3.2 孵育和观察 鸡胚接种后 , 每日照蛋一次，将在 60 小时前死亡的鸡胚弃去。60 小时后 , 每 48 小时照蛋一次 , 死亡的鸡胚随时取出 , 直至 96 或 120 小时 , 不论死亡与否 ,

4、全部取出 , 气室向上直立 , 置于 28冷却。3.3 收获 将冷却 424 小时的鸡胚取出 , 用碘酊消毒气室部位 , 然后以无菌手术剥除气室部卵壳，剪开尿囊膜，吸鸡胚液 , 每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶中，作好标识，留样后，结冻保存。在收获胚液的同时 , 应逐个检查鸡胚 , 如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。4半成品检验4.1 无菌检验 经处理过的胚液 , 每组分别取样 , 按无菌检验或纯粹检验标准操作规程 进行无菌检验 , 应无细菌生长。4.2 病毒含量测定按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为 10 倍系列稀释，取 10-7 、10-8 、10-9 3

5、个稀释度各尿囊腔内接种 10 日 SPF鸡胚 5 个，每胚 0.1ml ，置 3637继续孵育， 48 小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在 48120 小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至 120 小时，取出所有活胚 , 逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价 1:160 ( 微量法1:128) 者判为感染，计算 EID50，每 0.1 ml 病毒含量 107EID50 者可用于配制疫苗。5配苗及分装将检验合格的若干组鸡胚液滤过 , 混合于同一容器内 , 按规定羽份 , 加一定比例的蔗糖脱脂奶粉作稳定剂 , 使其最终蔗糖含量为 2.5

6、%，脱脂奶粉含量为 5%，同时加入适宜的抗生素 , 充分摇匀 , 定量分装 , 每羽份病毒含量应 10 6 EID50。分装后迅速进行冷冻真空干燥。6成品检验6.1 物理性状6.1.1 外观检查 疫苗瓶上的标签，打印出的羽份或头份、生产批号、有效日期清晰可见、位置适当。瓶上的铝盖稳固不松动。6.1.2 眼观检查 将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色，海绵状疏松团块，然后再轻微振动，疫苗松动并与瓶壁分离，判为合格。6.1.3 溶解性检查 用稀释液注射到疫苗瓶内，经轻微振动，疫苗应迅速完全溶解，无粘块或粘团出现，判为溶解性良好。6.2 无菌检验 按无菌检验或纯粹检验标准操作规程 进行，如有菌生长，应

7、进行杂菌计数，并作病原性鉴定（按 杂菌计数和病原性鉴定操作细则 进行）和禽沙门氏菌检验每羽份非病原菌数应不超过 1 个（按 禽沙门氏菌检验法 进行）。6.3 支原体检验 按支原体检验法 进行，应无支原体生长。6.4鉴别检验6.4.1选择发育良好的10 日龄 SPF鸡胚 10 只，划出尿囊腔接种部位。6.4.2将疫苗用无菌生理盐水稀释至105.0 EID50/0.1mL ，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1 小时后，尿囊腔接种，每胚 0.1mL。6.4.3 将接种后鸡胚用石蜡封孔后， 置 37继续孵育， 观察 120 小时，在 24120小时内应不引起特异死亡，且至少存活 8 只，鸡

8、胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。6.5 外源病毒检验 按外源病毒检验法 进行。6.6 安全检验 下列方法任择其一。6.6.1 用鸡胚检验 将疫苗用无菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种 10 日龄鸡胚 10只，每胚 0.1ml （含 10 个使用剂量），接种后 2472 小时，鸡胚死亡率应不超过20%为合格。 如死亡率超过 20%，可用 20 个鸡胚重检 1 次，重检结果死亡率仍超过20%，该批疫苗判为不合格。6.6.2 鼻接种用鸡检验 用 27 日龄 SPF雏鸡 20 只，合成两组，第 1 组 10 只，每只滴0.05mL（ 10 个使用剂量）；第 2 组 10 只，不接种作为对照，两组在相同条件下

9、分别饲养管理，观察 10 日，应无不良反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不超过 1 只。6.7 效力检验 下列方法任择其一。6.7.1 用鸡胚检验6.7.1.1鸡胚选择选择发育良好的10 日龄 SPF鸡胚 15 个，划出尿囊腔接种部位，作出批组及滴度标记，每一滴度接种5 个。6.7.1.2疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释至1 羽份/0.1mL ，再作 10 倍系列稀释至 10-7 。6.7.1.3接种 分别取 10-7 、10-6 、 10-5 三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各5 个，每胚 0.1mL，用石蜡封孔。6.7.1.4孵育 置 37继续孵育至 120 小时，每天上、

10、下午各照检1 次，48 小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48120 小时死亡的鸡胚，随时取出放在 28冰箱中，至120 小时取出全部活胚放在 28冰箱中24 小时。6.7.1.5凝集价（ HA）测定与计算鸡胚半数感染量（EID50） 将冷却鸡胚取出，将同一稀释度的死亡鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价；将活胚逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价， HA160（微量法 128）者判为感染，计算半数感染量，每羽份106.5 EID50 （国家标准每羽份 10 6.0 EID50），判为合格。6.7.2 用鸡检验6.7.2.1鸡的选择 选取 30-60 日龄健康易感鸡（血凝集抑制价应4） 10 只。

11、6.7.2.2 疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释成每0.05mL含1/100使用剂量。6.7.2.3 免疫及攻毒每只鸡滴鼻接种0.05mL，1014 日后，连同条件相同的对照鸡 3 只，各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒 104.0 ELD50，观察 10-14部发病死亡，免疫鸡至少保护 9 只为合格。6.8 剩余水分测定 按剩余水分测定方法 进行，应符合规定。日，对照鸡全6.9 真空度测定 按真空度测定方法 进行，应符合规定。鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目种蛋消毒* SPF种胚种蛋选择前孵化新城疫灭活疫苗生产工艺流程1生产用毒种制备接种途径1.1毒种繁

12、殖* 接 种10-4-5），尿囊腔内将毒种用灭活生理盐水作适当稀释（如或 10照蛋时间接种剂量无菌检验接种* 后孵化及照蛋。选接种后72120小时之间死亡且病痕明显10 日龄 SPF鸡胚，每胚 0.1ml培养温湿度病毒含量的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌，且对冷蛋时间* 冷 蛋收获-15 冷冻保存冷蛋温度1： 512）以上的鸡胚液混合，定量分装于安1%鸡红细胞凝集价在 1：640（微量法铝盖分装瓶保护剂胶瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。1.2毒种鉴定纯化水粗洗配苗无菌检验粗洗清洗1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10 倍系列稀释，取

13、 10-7 、* 灭菌-9注射水洗分装前、中、后无检纯化水洗-810 日 SPF鸡胚 5 个，每胚 0.1ml ，置 363710、10 3 个稀释度各尿囊腔内接种继续孵育，48 小时以前死亡的鸡胚弃去不计， 在 48120 小时死亡的鸡胚随时取出，* 隧道烘箱灭分装* 脉动蒸汽灭菌收获鸡胚液，同一稀释度加塞干 燥的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120 小时，取出所有活胚 ,逐个收获冻干物理性状鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价 1:160 ( 微量法 1:128) 者判为感染，计出 箱安全检验无菌检验 压 盖外源病毒检验贴签抽样装箱入库算 EID50，每 0.1ml 病毒含

14、量应 10 8EID50。1.3毒种保存在 - 15以下保存，应不超过 6 个月。1.4毒种继代应不超过 3 代。2制苗材料选择选择发育良好9 10 日龄的易感鸡胚作为制苗材料。3制苗用毒液的制备3.1接种 取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4 或 10-5 ），每胚尿囊内接种 0.1ml ，接种后密封针孔，置 36 37继续孵育，不必翻蛋。3.2孵育和观察 鸡胚接种后，每日照蛋 1 次，将 60 小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每 4 6 小时照蛋 1 次，死亡的鸡胚随时取出，直至96 小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于28冷却 4 24 小时。3.3收获3.3.1鸡

15、胚液的收获 将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术破除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（谨防卵黄破裂） ，吸取胚液。对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价，血凝价低于 1：160（微量法 1：128）者应弃去。同时作无菌检查，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在 28左右保存，应不超过5日。3.3.2 鸡胚胎儿收获及浸出液的制备 在收获及胚液的同时， 取病变胎儿，去头、脚，用生理盐水洗 23 次，磨碎，制成（ 1： 5）（ 1：10）乳

16、剂，加适宜的抗生素适量，然后离心或以 4 层纱布一层铜纱网滤过，置自然沉淀 12 日，然后取样作无菌检查。以上清夜作为配制双相油乳剂疫苗用。4 灭活 将上述无菌胚液以 4 层纱布及一层细铜纱网滤过， 混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价。 其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入 10%甲醛溶液，随加随摇，使其能充分混合，甲醛溶液的最终浓度为 0.1%。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接触灭活剂。然后在37灭活 16小时（以瓶内温度达到 37开始计时）。期间振摇 3 4 次。在 28保存，应不超过 1 个月。5半成品检验5.1无菌检验 取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附

17、录448 进行，应无菌生长。5.2灭活检验取 10 日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6 个，每个接种灭活胚液0.23ml ，每日照蛋2 次，观察 5 日，鸡胚非特异死亡不应超过1 个。对所有胚液分别测定血凝价，应不出现血凝，认为灭活完全。如有可疑，应将可疑胚液进行重检，重检不合格者报废。鸡胚浸出液也按照上述方法检查。5.3 毒价测定将灭活前取出的胚液进行 10 倍系列稀释，取 10-7 、10-8 、 10-9 3 个稀释度分别接种9 10 日龄无鸡新城疫病毒抗体的鸡胚5 个，每胚尿囊内 0.1ml ，每日照蛋 2 次，观察 5 日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价1：80（微量法 1：64）以

18、上者，判为感染，计算 EID , 每 0.1ml病毒含量 108EID , 方可用5050于制苗。6单相油乳剂灭活疫苗制备6.1 油相制备 取注射用白油 94 份，加司本 -80 6 份，混合后，加硬脂酸铝 2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。6.2 水相制备 取吐温 -80 4 份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加灭活胚液96 份，充分振瑶使吐温 -80 完全溶解为止。6.3 乳化 取油相 3 份放于乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相 1 份，加完后再以 10000r/min 搅拌 2 5 分钟，在终止搅拌前加入 1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为 0.01%。乳化后，取 35

19、ml 以 3000r/min 离心 15 分钟，若有分层现，应重复搅拌 1 次。7双相油乳剂疫苗制备7.1 用乳化罐乳化7.1.1 水相、油相制备同单相苗，但水相制备中，鸡胚液是按 4%加入吐温，而鸡胚浸出液则按 6%加吐温。7.1.2 取油相 2 份放入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入胚液1份，加完后再以 10000r/min 搅拌。7.1.3 取鸡胚浸出液（单相苗鸡胚液等量）放于乳化罐，开动电机缓缓加入上述油包水单相苗，加完后再以 10000r/min 搅拌 25 分钟，在终止搅拌前加入 1%硫柳汞溶液，使最终浓度为 0.01.% 。乳化后取 3 5ml 以 3000r/min

20、 离心 10 分钟，若分层严重应再搅拌 1 次。7.2 用乳化罐乳化。8分装 定量分装，加盖密封。9成品检验9.1 物理性状9.1.1 外观 为乳白色乳剂。9.1.2 剂型 单相苗为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。双相苗为水包油包水型，滴于冷水中，应呈云雾状扩散。9.1.3稳定性在 37左右条件下放置 21 日，应不破乳。9.1.4粘度用 1ml 吸管（出口内径 1.2mm），吸取 25左右的疫苗 1ml，令其垂直自然流出，记录流出 0.4ml 所需时间。单相苗在 8 秒以内，双相苗在5 秒以内为合格。9.2无菌检验按无菌检验或纯粹检验标准操作规程进行，应无菌

21、生长。9.3安全检验用 30 60 日龄健康易感鸡（ HI 抗体 1： 4） 6 只，各肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察 14 日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。9.4效力检验用 30 60 日龄健康易感鸡（ HI 抗体 1： 4） 15 只，其中 10 只各皮下或肌肉注射疫苗 20l （用 0.5ml以下的注射器注射） ，另 5 只不免疫作对照， 21 28 日后，连同条件相同的对照鸡5 只，各肌肉注射510 ELD 强毒，观察5014 日，对照组全部死亡，免疫组至少保护7 只为合格。9.5 甲醛含量测定 按甲醛含量测定法 进行，应符合制品检验的有关规定 。鸡新城疫灭活疫苗生

22、产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目*种蛋消毒非免疫种蛋前孵化种蛋选择无相应抗体附录1. 剩余水份测定法接种途径1* 接 种技术依据及原理接种剂量无菌检验照蛋时间* 后孵化及照蛋灭活检验培养温湿度卡氏法是利用卡氏试剂中的碘和二氧化硫在砒啶和甲醇溶液中能与水起定量毒价测定冷蛋时反应的原理，从而测定水份。间* 冷 蛋收 获* 灭活-15 冷冻保存冷蛋温度材料、仪器、试剂的准备及基本要求2铝盖分装瓶胶 塞2.1仪器及设备*油相制*水相制清洗清洗清洗* 乳化* 灭菌 分装前、中、后无检 * 脉动蒸汽灭菌电子分析天平（精度 0.1mg，称量范围 0 110g），费休水份滴定仪 ( 梅特勒DL31)。2

23、.2 试剂卡氏试剂、无水甲醇，纯水。2.3 检验器具止血钳（开启苗瓶） ，玻璃棒（或能捣碎检品的器具） ， 10ul 注射器，烧杯。2.4 样品 每批疫苗 4 个样品。2.5 其它 检验记录纸、笔、纱布和汗布手套。3检验步骤3.1 接通电源、打开费休水份滴定仪 ( 梅特勒 DL31)主机、打印机、天平开关。3.2 按滴定仪的 RUN键滴定仪自动滴定至终点。3.3 滴定仪屏幕显示待机模式 Drift 值在 25 以下指示箭头稳定 ( 平指 ) 时，开始滴定标定滴度：3.3.1按 F2 键至显示屏出现 H2O ISO 36963.3.2连续按 F3 键至显示屏出现 please add sampl

24、e 0.0100 g3.3.3天平去皮，通过进样孔注入已称重的纯水，( 用 10l 注射器抽取 10l纯水置天平称重 ) 注射器放回天平后按 F3;3.3.4 按 F1 自动输入样品量；3.3.5 按 F2 显示样品重量；3.3.6 按 F3 确认样品重量；3.3.7 滴定至终点自动打印出结果，打印结束按 F3 返回到待机模式；3.3.8 重复标定只需依上述第 1 条开始同法操作。3.4水份测定：3.4.1将样品置天平称重3.4.2连续按 F3 键，显示屏出现 please add sample 0.0000g 5.000g;3.4.3天平去皮后通过进样口将已称重的样品加入滴定杯中，将载样杯放

25、回天平。3.4.4按 F3预滴定3.4.5按 F1自动输入样品量3.4.6按 F2显示样品重量3.4.7按 F3确认样品重量3.4.8 滴定至终点自动打印出结果，打印结束，按 F3 返回到待机模式3.4.94记录与计算5结果判定每瓶样品含水量不得超过 4.0 ，如有超过时，可重检一次。2.真空度测定法1技术依据及原理依据兽用生物制品质量标准附录中的真空度测定法，即使用高频火花真空测定器测定。它的基本原理是利用本仪器振动形成火花束，激励谐振荡回路，使次线线圈感应出高频高压脉冲电压，使被检物产生不同颜色的辉光，根据颜色的变化来判断疫苗的真空度。2注意事项2.1 按照规定要求，在检验过程中至少要有一名检验员和一名复核员共同进行，确保检验结果的准确性。2.2 检验要在光线较暗的操作室里进行，便于结果判定的准确性。2.3 被检样品从冷库中取出应擦干瓶壁上的水份，样品达到室温后再进行测定。3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器及设备电火花真空检测器。3.2