天然药物化学成分常用分离纯化方法.docx

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天然药物化学成分常用分离纯化方法

第三章天然药物化学成分的常用分离纯化方法

§1．概述

一、研究分离纯化技术的重要性

（一）制备工艺研究的重点

原料经提取加工所得的提取物通常是一个成分复杂的混合物，只有经过进一步地分离纯化，才能得到纯度较高的化学成分。

提取分离纯化检识

除去部分或全部杂质

提取物目标成分

（杂质＋化学成分）（纯度提高）

（二）检测分析研究的重点

天然产物工作中，无论原料或终产品，经常会是混合物；这些含有杂质成分的样品，检测分析之前，一般都需要做前处理，以便除掉干扰分析的杂质，否则，检测分析工作常常难以进行。

要除掉待测样品中的杂质，同样需要分离纯化技术：

前处理

待测样品供试样品检测分析

分离纯化

除掉干扰检测

分析的杂质组分

由上述可见，分离纯化同样也是检测分析的研究重点

二、研究分离纯化方法的基本思路

动、植物原料的提取物的化学组成经常是很复杂的，往往含有几十、几百甚至近千种成分（包括微量成分）。

要从众多成分中分离纯化某种化学成分，其难度可想而知，究竟应当如何着手呢？

其实我们只要抓住一个重要的基本思路，就可以使许多看似困难的分离工作，变得比较容易，这个思路就是：

寻找差异、利用差异

决定分离难易的关键：

不在于成分多少,而在于差异大小。

只要存在显著差异，从上千种成分中分离出某种成分也未必困难；反之，如果差异微小，即便是两种成分的分离，也会相当棘手。

学习和研究分离纯化技术，重在把握思路，切忌生搬硬套，死记硬背，应当重视培养“善于寻找差异和利用差异”的良好习惯。

尽管天然产物中成分众多，然而只要细心研究，总能发现被分离成分之间的某些差异。

在分离纯化工作中可以利用的差异是很多的，其中最常利用的有四类差异：

溶解度（或分配系数）、酸碱性（或解离度）、吸附性、分子量

以下，我们便对此进行研究探讨。

§2利用溶解度（或分配系数）差异进行分离纯化的方法

一、直接利用溶解度差异

溶解度差异是分离纯化工作中经常考虑利用的重要差异类型。

（一）主要用途：

用于分离溶解度不同的成分，通常也是极性不同的成分（溶解度与极性相关）。

（二）主要原理：

相似相溶参见第二章：

二1

（2）.

（三）常用方法

基于溶解度差异的分离方法，常见有三种：

抽提法、沉淀法、萃取法

1．抽提法（溶剂抽提法）溶液（可溶部分）

提取物干燥粉碎溶剂抽提、分离

残渣（不溶部分）

实验装置图示:

ABC

该方法操作与装置皆很简便。

如上图所示，小量操作在图A试管中即可进行搅拌抽提，稍大量可置图B磁力搅拌器中自动搅拌，再大量还可用大型烧瓶（图C）搅拌抽提，如用有机溶剂抽提，图B、C上方应连接回流冷凝管，切忌有机溶剂挥发逸出。

抽提完成后，图A试管可直接离心分离，图B、C装置抽提完成后，可酌情离心或过滤分离。

由上述不难看出，抽提法经过简便操作，即可利用溶解度差异分离获得两类组分。

练习：

带有冷苯

汉防己甲素甲基可溶

汉防己乙素羟基难溶

试写分离流程：

冷苯抽提

过滤

滤液（……甲素）

残渣（……乙素）

混合物

2．沉淀法（溶剂沉淀法）

缓缓滴加另一溶剂分离溶液（可溶成分）

提取液混浊、析出沉淀

与原溶剂极性不同沉淀（不溶成分）

但可与之混溶

实验装置与上述抽提法相似，见上图。

需要注意的是沉淀法与抽提法的重要区别在于：

⑴在该法中被分离物料是液体。

⑵该法所加溶剂的目的不是用于溶解，而是用于使某种成分难溶析出，因而必须从极性角度仔细选择溶剂种类，所加溶剂既要能够与原溶剂相混溶，又必须与原溶剂的极性存在显著差异，能使最终的混合溶剂的极性与原溶剂发生显著变化，从而使某些成分随着溶剂的极性改变而由可溶状态转为不溶或难溶状态沉淀析出，达到分离目的。

沉淀法与抽提法也有共同之处：

操作之后都存在固液两相，因而其最终的分离措施是相似的，诸如离心、过滤等都是常用方法。

沉淀法流程实例：

3．萃取法

亲脂溶剂相（脂溶成分）

加入有机溶剂振摇静置分层

水提取液

如石油醚、充分混匀

乙醚、氯仿等水相（水溶成分）

实验装置图示:

萃取操作也较为简便，所用装置可大可小，然而应注意防止乳化。

萃取流程实例：

萃取

萃取脱脂

（四）两大技巧

1．梯度处理

以上三法皆可进行梯度处理，例如梯度抽提（分步提取），梯度沉淀（分步沉淀），梯度萃取。

普通的溶剂处理法，仅能用于分离极性差异较大、溶解度差异较大的成分，应用受到一定限制；而梯度处理法可以收到更好的分离效果。

2．组合应用

如：

水提醇沉水提醚萃分离效果更好

二、改变溶解度差异进行分离

对于溶解度差异较小而不易分离的成分，还可同过多种手段增大其溶解度差异，例如：

改变温度：

降温法、升温法等

加入某种试剂：

铅盐沉淀法等

制备衍生物：

酯化、磺化等。

§3．利用酸碱性（或解离度）差异进行分离纯化的方法

一.利用酸碱性差异分离-----酸碱溶液处理法

（与溶剂处理法相似）也有三大方法：

（抽提法沉淀法萃取法

）

基本原理：

成盐

二.利用解离度差异分离-----离子交换法

一．利用酸碱性差异分离-----酸碱溶液处理法

（一）酸碱抽提法

总提取物，依次用酸水、碱水简单处理之后，往往能够很容易分为碱性、酸性及中性三大类成分。

实例：

①酸水抽提

酸水溶液（碱性成分成盐，溶出）

（常用1~2％盐酸）

总提取物②碱水抽提

粉末、颗粒碱水溶液（酸性成分成盐，溶出）

或浸膏等（常用0.1MNaOH）

③中性溶剂抽提

中性溶液（中性成分溶出）

（水或有机溶剂）

酸水溶液（生物碱盐）

生物碱提取物

（酒精浸膏）

酸水抽提过滤

不溶物（杂质）

（二）酸碱沉淀法（可与抽提法或萃取法配用）

1.碱溶酸沉法

溶于碱水

酸型成分盐型成分

含-COOH酸化、析出沉淀

或酚OH

实例：

大黄水解提取物（氯仿溶液）

[碱溶]碱水萃取

分层

氯仿溶液（含脂溶性杂质）

碱水溶液（与脂溶性成分分离）

[酸沉]酸化（pH2~3），析出沉淀

过滤

酸水液（酸水可溶性杂质）

大黄总蒽醌苷元（与水溶性成分分离）

2．酸溶碱沉法

溶于酸水

碱型成分盐型成分

碱化析出沉淀

（三）酸碱萃取法

（1）用酸水或碱水萃取有机相（与其它脂溶性成分分离）

用酸水从有机溶剂中萃取出碱性成分（成盐而溶于酸水，未成盐的亲脂性杂质留于有机溶剂）

或用碱水从有机溶剂中萃取出酸性成分（成盐而溶于碱水，未成盐的亲脂性杂质留于有机溶剂）

实例：

大黄总蒽醌苷元（氯仿溶液）用碱水萃取精制（见上方实例流程图）

（2）用有机溶剂萃取酸水或碱水溶液（与水溶性成分分离）

通常，未成盐的亲脂性成分被有机溶剂萃取，能成盐的亲脂性成分留于酸水或碱水溶液（实现分离）

（3）组合法

1o酸水萃取碱化有机溶剂萃取

有机相

酸水萃取（初步分离）

分层

有机相（中性或酸性亲脂成分）

酸水液（碱性亲脂成分成盐，例如生物碱盐）

碱化

有机溶剂萃取（再次分离）

分层

碱水液（水溶性成分）

有机相（碱性亲脂成分，例如生物碱）

2o碱水萃取酸化有机溶剂萃取

原理与（3）1o相似，可用于精制酸性亲脂成分

（四）pH梯度处理法

普通的酸碱处理法，仅能用于分离酸性、碱性和中性成分；而pH梯度处理法还能分离酸性（或碱性）强弱不同的成分。

PH梯度处理也分为抽提、沉淀、萃取法。

1．pH梯度萃取法

实例：

大黄中几种酸性强弱不同的蒽醌苷元的分离

5％NaHCO3萃取

强酸性成分（例如大黄酸）

pH＝8

pH梯度萃取

5％NaCO3萃取

酸性总提取物弱酸性成分（例如大黄素）

碱性依次增强pH=10

0.5%NaOH萃取

酚性成分（例如芦荟大黄素）

同上原理，也可用不同酸度的酸水分离碱性强弱不同的成分。

2．pH梯度抽提法和pH梯度沉淀法

与上述pH梯度萃取法原理相似。

二、离子交换法――（利用解离度差异）见Ch.5层析法

§4利用吸附性差异进行分离

一常用吸附方法的分类

（一）按吸附原理分：

1物理吸附（表面吸附）：

它是由构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。

物理吸附无选择性，可逆，应用广。

2化学吸附（发生化学反应）：

吸附剂与被吸附成分各有酸、碱基团时，相互之间会发生化学吸附；例如碱性氧化铝（属碱性吸附剂）与酸性成分之间的吸附，或者硅胶（属弱酸性吸附剂）与生物碱成分之间的吸附等都属化学吸附。

化学吸附具有选择性，难解吸，甚至不可逆，应用较少（通常多回避）。

3半化学吸附（例如聚酰胺氢键吸附），吸附力较弱，介于上述二者之间，应用较多（见§6）。

（二）按被吸附成分与吸附剂的相对关系来分：

1静态吸附（又称简单吸附法，例如活性碳脱色）

向被处理液体中加入吸附剂，搅匀、充分吸附后，将吸附剂与被处理液体分离（过滤或离心等），必要时重复上述操作多遍，以达到充分吸附。

有必要洗脱时，再合并吸附剂另行洗脱；吸附杂质时通常不再洗脱（参见下图）。

2动态吸附（又称吸附层析法，例如活性碳柱层析）

吸附剂装入层析柱中（见下图），加洗脱剂至略高于吸附剂，加被分离样品于柱顶，洗脱剂由上方不断滴加，从下方不断流出。

在洗脱剂的作用下，被吸附成分不断离开上方吸附剂，又被下方吸附剂重新吸附，按其吸附性强弱不同而被分离成不同的层析谱带（见下图）。

静态吸附装置图示：

动态吸附装置图示：

3静态吸附与动态吸附的比较（见下表）

主要特征

对吸附强度的要求

主要用途

常见实例

吸附与洗脱过程

被吸附成分与吸附剂之间

被分离成分之间的

吸附性差异

静态吸附

又称简单吸附法

分别进行

属间歇性操作

一次性吸附

一次性洗脱

处于相对静止状态

显著

多为质的区别

（可吸附与不吸附）

强吸附

多用于去除杂质（通常杂质含量偏少，杂质可吸附，目标成分不吸附或少吸附）*

活性炭脱色

植物油酸性白土脱色等

动态吸附

又称吸附层析法

同时进行

属连续性操作

重复吸附

连续洗脱

不断发生相对位移

较小

多为量的区别

（都能被吸附，吸附强弱有区别）

弱吸附，

从而实现吸附、洗脱、再吸附、再洗脱的动态过程

以便分离

多用于分离极性近似的成分（其吸附性也相近）

活性炭层析

氧化铝层析

硅胶层析等

本节重点：

物理吸附中的静态吸附

二．物理吸附法（重点讨论静态吸附）又称简单吸附法

（一）基本规律：

相似相吸（与极性有关，类似于“相似相溶”）

物理吸附法虽无选择性，但其吸附强弱及吸附先后顺序，遵循这一规律。

“相似者易于相互吸附”，极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。

（二）影响因素（吸附三要素）

吸附剂

溶质（被分离物质）溶质与溶质（争吸）竞争吸附（争夺吸附剂表面）

溶剂溶剂与溶质（解吸）

吸附效果与上述三者的结构特点及极性强弱有关

（三）吸附剂和洗脱剂的分类

吸附剂按极性不同可分为以下两大类：

极性吸附剂非极性吸附剂

别名亲水性吸附剂亲脂性吸附剂

易吸附亲水性成分亲脂性成分

实例氧化铝、硅胶活性碳

活化需去水需去气

洗脱剂按极性不同可分为：

亲水性洗脱剂、亲脂性洗脱剂。

（四）、吸附剂和洗脱剂的选择原则（见下表）

被吸附成分

吸附剂应选用

洗脱剂应选用

原理

小结

在静态吸附中

亲水性成分

亲水性吸附剂

亲水性洗脱剂

利用

相似相吸实现强吸附

吸附剂和洗脱剂的极性均与被吸附成分一致

亲脂性成分

亲脂性吸附剂

亲脂性洗脱剂

在动态吸附中

亲水性成分

亲脂性吸附剂

亲水性洗脱剂

利用相异弱吸实现弱吸附

吸附剂的极性与被吸附成分相反

洗脱剂的极性与被吸附成分一致

亲脂性成分

亲水性吸附剂

亲脂性洗脱剂

（五）简单吸附法的应用

1．精制（吸附杂质）

（1）活性碳脱色常用于提取液精制或结晶、重结晶的操作。

（2）酸性白土脱色、脱臭

用于植物油或脂肪酸精制，效果很好，脱色的同时兼有一定程度的脱臭作用。

例如，花生油脱色；鱼油多不饱和脂肪酸EPA、DHA类产品脱色。

2．浓缩（富集）（吸附有效成分）

用于从大量稀水溶液中浓缩微量物质。

例如，从一叶萩水浸液中浓缩分离抗肿瘤成分一叶萩碱。

方法为：

将水浸液pH调至碱性（pH8.5），分次加入活性碳，搅拌，静置，直到上清液检查无生物碱反应时为止。

滤集吸碱炭末，干燥后，与苯回流，苯液回收即得一叶萩碱。

§5利用分子量差异进行分离

一、透析法

1．原理

利用小分子量及小离子化合物在溶液中可通过透析膜，而大分子及大离子化合物不能通过透析膜的性质，借以达到分离的目的。

2．应用

此法通常用于分离纯化化学成分提取物中的大分子成分，如皂苷、蛋白质、多肽、多糖等成分，以除去混杂其中的无机盐、单糖、双糖等小分子化合物。

二、超滤法和超速离心法

超滤法：

利用因分子大小不同所引起的扩散速度的差别，进行分离。

超速离心法：

利用溶质在超速离心引起的重力场作用下具有不同的沉降性或浮游性。

§6其它分离方法简介

利用各种差异的分离方法还有很多，例如：

分馏法：

是利用混合物中各组分的沸点不同，因而在分馏过程中产生蒸汽压的高低差别而得以分离的方法。

升华法：

是利用某些固体物质在低于其熔点的温度下，受热后不经过熔化便可直接转化为气体，遇冷后又直接凝结为固体的性质，借以达到与其它成分的分离。

超临界流体提取分离法：

见前述

附：

化学成分提取分离其它实例

一、从槐米中提取芦丁（碱溶酸沉法）

沸水提取：

取槐米加入约6倍量水，煮沸，

碱溶：

搅拌下缓缓加入石灰乳至PH8–9，微沸20–30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎煮一次，乘热抽滤，合并滤液。

酸沉：

取上述滤液，在60–70℃下，用浓盐酸调至PH为5，搅匀，静置24小时，抽滤，分出沉淀物，水洗至中性，60℃干燥得芦丁粗品。

重结晶纯化：

水中重结晶，70–80℃干燥得芦丁纯品。

注：

⑴碱化时选用石灰乳或石灰水是因其含有Ca（OH）2，兼有钙盐沉淀法的作用，可除去含-COOH的水溶性杂质，如果胶、粘液质等。

⑵使用碱溶酸沉法纯化时，酸碱浓度均不宜过高；强碱，尤其加热时易破坏黄酮母核，酸性过强会形成钅羊盐，使析出的黄酮类化合物又重新溶解，产品收率反而降低。

二、人参总皂苷的制备方法

分离：

萃取法

提取：

浸渍法

三、远志总皂苷的制备

溶剂提取：

石油醚脱脂

乙醇提苷

分离：

醇提酮沉（溶剂沉淀法）