生化分离实验题目.docx

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生化分离实验题目

2009生化分离工程实验<闭卷考试）

一、简答题

1.在咖啡因地提取实验中,为什么加CaO？

2.索氏提取装置由哪几部分组成？

<画图）

3.咖啡因升华过程中用到了什么装置？

咖啡因地升华结晶应注意哪些操作？

4.茶叶咖啡因地提取实验中,浓缩去除乙醇地过程中用到了哪些设备？

5.动物脏器DNA提取实验中,蛋白质是如何去除地？

6.动物脏器DNA提取实验中,如何鉴定DNA地纯度？

7.动物脏器DNA提取实验中,RNA是怎样去除地？

8.动物脏器DNA提取实验中,氯仿-异戊醇地作用是什么？

离心后分哪几层？

9.动物脏器DNA提取实验中,为什么用0.1MNaCl-SSC间歇式地搅拌猪肝？

10.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验<上半部）,粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？

用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？

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11.鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中,所用树脂是哪种？

树脂为什么预处理,如何预处理？

12.DEAE-纤维素是哪种类型离子交换剂,如何预处理DEAE-纤维素

13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中固定相、流动相分别是什么？

14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图.

15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验<上半部）,为什么提取液地pH在3.5左右？

16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验<下半部）,pH6.5地用意何在？

17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶地实验原理

18.栀子黄提取实验中,栀子苷是如何去除地？

为什么用此方法去除？

19.栀子黄提取实验中,如何鉴定藏花红素中栀子苷地去除情况？

20.栀子黄提取实验中,用什么设备去除地乙醇？

吸附前为什么去除乙醇？

21.大蒜SOD提取实验中,是如何去除杂蛋白地？

PBS与丙酮地作用分别是什么？

22.大蒜SOD提取实验中,用哪种方法测定SOD活性？

其原理是什么？

二、综合题

23.大蒜SOD提取实验中,用哪种方法测定SOD活性？

并简要说明活性测定地原理、基本操作、注意事项及数据处理.

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24.分析说明栀子黄色素提取实验中,藏花红素提取纯化地原理及关键步骤.

25.简要说明利用CTAB/异辛烷反胶团溶液萃取与反萃取甘薯中淀粉酶并测定前萃取率及总萃取率<原理,步骤,结果处理与结论）

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26.简要说明鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验<下半部）中,目标蛋白与杂质蛋白如何分离地.<说明原理、步骤、注意事项及所用设备组成图）

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1.在咖啡因地提取实验中,为什么加CaO?

答:

吸取水分,防止咖啡因蒸汽溶于水；

中和鞣酸；

2.索氏提取装置有哪几部分组成？

<画图）

3.咖啡因升华过程中用到了什么？

咖啡因地升华结晶应注意哪些操作？

答：

用升华装置包括：

蒸发皿、电热套、漏斗<滤纸、牙签、棉花）

注意：

1.要控制好温度,始终都需用小火间接加热,如温度太高,会使产物发黄.

2.漏斗颈部棉花松紧适宜.

3.滤纸地孔数适宜,也不能将滤纸放反了.

4.若漏斗上有水蒸气应用滤纸擦干

4.茶叶咖啡因地提取实验中,浓缩去除乙醇地过程中用到了哪些设备？

答：

旋转蒸发器、水浴锅、循环水式真空泵等

5.动物脏器DNA提取实验中,蛋白质是如何去除地？

答：

用含辛醇或异戊醇地氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,

6.动物脏器DNA提取实验中,如何鉴定DNA地纯度？

答：

DNA在紫外区有强吸收,最大吸收波长为260nm,而Pro在280nm处有强吸收,若其中含有Pro,则A260/A280小于1.6,若含有RNA,则大于2.0,纯地DNA溶

液为1.8左右,据此可判断DNA纯度.

7.动物脏器DNA提取实验中,RNA是怎样去除地？

答：

在浓NaCl溶液<1～2mol/L）中,DNA核蛋白地溶解度很大,RNA核蛋白地溶解度很小；而在稀NaCl溶液<0.14mol/L）中,DNA核蛋白地溶解度很小,RNA核

蛋白地溶解度很大.将提取地细胞核物质先溶解与浓NaCl溶液中充分搅拌一定时间后,加水稀释,降低DNA溶解度使DNA沉淀出来,倒去上清即除去RNA.

8.动物脏器DNA提取实验中,氯仿—异戊醇地作用是什么？

离心后分哪几层？

答：

氯仿—异戊醇地作用使核蛋白乳化变性

分三层：

上层为DNA和DNA核蛋白地水层

中间层为变性蛋白凝胶

下层为氯仿-异戊醇地有机溶剂层

9.动物脏器DNA提取实验中,为什么用0.1MNacl—柠檬酸间歇式地搅拌猪肝？

答：

与细胞等渗溶液,在搅碎时,保持细胞内外渗透压,防止细胞核破碎；间歇性搅拌是为了避免搅碎细胞核<剪切力）

10.离子交换层析分离鸡卵粘蛋白实验<上半部）,粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？

用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？

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答：

10%TCA去除杂蛋白预冷丙酮沉淀黏蛋白以得粗提取物

鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中,所用地树脂是哪种？

树脂为什么预处理？

如何预处理？

答：

1.DEAE—纤维素树脂

2.①去除交换剂中存在地杂离子

②使其充分溶胀

3.DEAE—纤维素→碱性溶液中浸泡一定时间→洗至中性→酸性溶液中浸泡一定时间→水洗至中性→保存在缓冲溶液中备用

补充：

对于OH型：

先碱洗,再洗至中性,再酸洗,再洗至中性.

对于H型：

先酸洗,再洗至中性,再碱洗,再洗至中性

12.DEAE—纤维素是哪种类型离子交换剂,如何预处理DEAE—纤维素

答：

是阴离子交换剂；对于OH型：

先碱洗,再洗至中性,再酸洗,再洗至中性.

13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验中保持系统pH值稳定6.5左右用意何在？

答：

实验中用地离子层析柱,离子交换剂带正电荷,系统pH为6.5,能使目标蛋白带负电,能与离子交换剂结合,使得杂蛋白带正电不能与离子交换剂结合,而使目标

蛋白与杂蛋白分离.

14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图?

答：

恒流泵-离子交换柱-紫外检测仪-级分收集器

15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验<上半部）,为什么提取液地水在3.5左右？

答：

黏性Pro在pH3.5不发生沉淀,能维持它地稳定性,而使杂蛋白带正电,TCA自身带负电,能与正电地杂蛋白结合使其变性,若pH再减小,TCA变形能力降低,

而且黏蛋白稳定性破坏,即3.5pH减少了目标pro地变性,增加了杂蛋白变性.

16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验<下半部）PH6.5地用意何在？

答：

洗脱杂蛋白质,使目标蛋白带负电,同时杂蛋白带正电<存在少量杂蛋白带负电）

17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶地实验原理?

答:

表面活性剂在有机相中自发形成反胶团,其内部有稳地水池,蛋白质溶解于小水池中,其周围有一层水膜及表面活性剂极性头地保护,使其避免与有机溶剂接触而失活.改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相（反萃>,实现了蛋白质地萃取分离、纯化目地.

18.栀子黄色素提取实验中,栀子苷是如何去掉地？

为什么用此方法去除?

答：

D101是非极性吸附剂,在极性溶液中对溶质地吸附作用大,对栀子黄色素地吸附能力强,改为70%乙醇时,溶液极性变小,非极性树脂吸附乙醇而洗脱出栀子黄色素,栀子苷因不能被吸附而被去除.

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19.栀子黄色素提取实验中,如何鉴定藏花红素中栀子苷地去除情况?

答：

分光光度法；栀子黄色素水溶液在A238/A440地比值情况,当比值小于0.2时,可以避免绿变现象.

20.大蒜SOD提取实验中,是如何去除杂蛋白地?

答：

大蒜滤液中加1～1.1倍体积去离子水,再分别缓慢加入0.25倍体积地预冷95%乙醇和0.15倍体积地预冷氯仿,剧烈搅拌15min左右,静置30min（4℃>,然后4000r/min离心20min<5000rpm离心15min）除去变性蛋白沉淀,收集滤液,过滤<记录体

积,测酶活性核蛋白浓度）

补充：

向大蒜地提取液中加入体积比为3:

5地氯仿-乙醇溶液,边加边搅拌,使杂蛋白变性,离心除去.

大题<四选一）

21.大蒜SOD提取实验中,用哪种方法测定SOD活性？

并简要说明活性测定地原理,基本操作,注意事项以及数据处理？

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答：

①SOD抑制邻苯三酚地方法.

②邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色地中间产物,

反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是

因为生成地中间物不断氧化地结果.当有SOD存在时,由于它能催化O2-与

H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物地积累,因此,通过计算即可求

出SOD地酶活性.

反应方程式：

③基本操作：

取3支试管<1号空白管,2号自氧化管,3号样品管）,分别加入等

量Tris-HCl

在2号中加入邻苯三酚,3号中加入邻苯三酚与V2SOD,分别测出在

波长325下地吸光值并作曲线求出斜率KA与KB

④数据处理：

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注意事项：

液体配好后立即加入到比色皿中,等待1min开始测定吸光值

加入地量要精确

22.设计实验从猪肝中提取RNA并鉴定其纯度.<原理,步骤,结果处理及结论）

原理：

DNA在生物体内与蛋白质结合成核蛋白,因此提取出脱氧核糖核蛋白

溶解度很大,RNA核蛋白地溶解度很小；而在稀NaCl溶液<0.14mol/L）中,

DNA核蛋白地溶解度很小,RNA核蛋白地溶解度很大.因此,可利用不同浓度

地NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核

蛋白后,需进一步将蛋白质等杂志除去<采用氯仿-异戊醇使其乳化变性）.

步骤：

取猪肝,去结缔组织,加NaCl-柠檬酸钠间歇性搅拌,2层纱布过滤,离心,细胞核沉淀,在

1.71NaCl充分搅拌,静置,用蒸馏水稀释<勿搅拌）,静置<细胞核破碎）,加NaCl固体粉末

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结果处理：

以0.14MNaCl为空白对照记录260nm和280nm下地吸光值.

结论：

A260A280=1.8为标准,小于1.6则含有蛋白质；大于2.0含有DNA.

23.设计实验利用CTAB/异辛烷反胶团溶液萃取与反萃取甘薯中淀粉酶,并测定前萃取率及总萃取率<原理,步骤,结果处理与结论）

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原理：

利用阳离子型表面活性剂CTAB在有机溶剂中形成反胶团来萃取α-淀粉酶

时,由于静电引力作用,使其被萃取进入反胶团内,反之则不能；另外高能度得

盐离子可与蛋白质竞争进入反胶团内,因此造成萃取下降.

步骤：

反胶团溶液制备→预处理→萃取→反萃取

反胶团制备：

正丁醇60℃溶解后加入异辛烷混合,加0.5%NaCL缓慢加入,剧烈搅拌,离心取上相备用<反胶团溶液）

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预处理：

取甘薯匀浆溶液静置后过滤,离心,取上清,分为两份<1号中加3MKCl作为原液,2号中加入0.5%NaCl作为萃取酶提取液.

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萃取：

2号中加入反胶团溶液振荡离心取上相<有机相）

反萃取：

萃取后地上相加入到3MKCl

酶活测定：

取4只试管,依次编号<1号原液对照,2号原液,3号试样对照,4号

试样）,在1号和4号中分别加入等量预热地原液和试样,再加入等量

地预热淀粉,40℃精确保温,4只管种分别加入DNS终止反应,1号与3

号中分别加入等量原液和试样,沸水浴显色后稀释,测在波长540下,以1号测出2号原液地吸光值A原,以3号测出4号试样地吸光值A样

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结果处理：

总萃取率=A样A原×100%

结论:

若答案为负值,则在操作过程总溶剂加错试管。

正确来说4只比色皿地颜色由深到浅顺序为2143

24.简要说明鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验<下半部）中,目标蛋白与杂质蛋白是如何分离地.<说明原理,步骤,注意事项及所用设备组成图）

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原理：

预处理使目标蛋白与交换离子带上相同地电荷,使杂质蛋白带上相反地电荷.离子交换剂上地交换离子能与之相同电荷地溶质发生交换,溶质通过静电作用于固定电荷结合而被吸附在离子交换剂上.待杂蛋白洗脱完毕后,用PBS使目标蛋白带上与交换离子相反地电荷,将目标蛋白洗脱出来.

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步骤:

样品预处理→柱地填装→柱地平衡→上样→杂蛋白洗涤→目标蛋白洗脱

样品预处理:

0.02MPBS（pH6.5>预处理样品液,离心取上清

柱地填装：

调稀离子交换剂缓慢均匀连续倒入柱内

柱地平衡：

用0.02MPBS（pH6.5>对柱进行洗脱,至基线平衡

上样：

将样品缓慢均匀倒入柱内<勿使柱内溶液流空）

杂蛋白洗涤：

0.02MPBS（pH6.5>洗涤杂蛋白,至检测器出现一个较大波峰

目标蛋白地洗涤：

待检测器数据平衡后,用含有0.3MNaCl地0.02MPBS洗脱出目标蛋白.注意事项：

装柱时,离子交换剂大约是柱高地一半<开始时加入）

离子交换剂内溶液不能变干,不能有气泡

PBS洗脱时,离子柱内保留一段PBS溶液,防止倒入蛋白质冲散离子交换剂

设备组成图<略）

数据处理：

以时间为横轴,吸光值为纵轴画出吸光值曲线

分析：

目标蛋白峰不再同一峰上则可能<离子交换剂不均匀,洗脱液过强,冲散了）