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学士论文
分类号：
R96单位代码：
10159
学号：
072111
学士学位论文
题 目：
miR-302a对乳腺癌细胞耐药的调控作用与机制研究
InvestigationofmiR-302aregulatingmultidrugresistanceinbreastcancercells
本科生：
导 师：
学科专业：
药学（临床药学）
论文课题起止时间：
2012年10月—2013年4月
论文完成时间：
2013年4月
中国医科大学研究生学位论文独创性声明
本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名：
张 聪日期：
2013年５月２日
中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书
本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：
研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。
本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。
学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。
学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。
论文作者签名：
指导教师签名：
日期：
2013年５月２日
目 录
一、摘要
中文论著摘要……………………………………………………………………1
英文论著摘要……………………………………………………………………3
二、英文缩略语………………………………………………………………………4
三、论文
前言………………………………………………………………………………5
材料与方法………………………………………………………………………6
实验结果（附论文图片）………………………………………………………12
讨论………………………………………………………………………………14
结论………………………………………………………………………………15
四、本研究创新性的自我评价.....................................................................................16
五、参考文献…………………………………………………………………………16
六、附录
综述………………………………………………………………………………18
致谢………………………………………………………………………………26
个人简介…………………………………………………………………………27
·中文论著摘要·
miR-302对乳腺癌细胞耐药的调控作用与机制研究
摘要
化疗在乳腺癌的综合治疗中起着不可替代的作用，但治疗中出现的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）严重影响了临床疗效及患者预后。
乳腺癌耐药蛋白（breastcancerresistantprotein,BCRP）作为一种重要的ABC转运蛋白，能够通过水解ATP供能将转运底物（化疗药物）从细胞内逆浓度梯度泵到细胞外，从而导致细胞对药物抵抗、诱导耐药性产生。
近年来研究发现微小RNA（microRNA，miRNA）在逆转肿瘤细胞耐药过程中起到重要作用。
方法
RealtimeRT-PCR检测miR-302a表达差异及BCRPmRNA水平；荧光素酶报告分析检测miR-302与BCRPmRNA是否存在结合位点；蛋白免疫印迹法检测耐药蛋白表达并进行统计分析。
结果
本实验经过荧光素酶报告分析，确定在BCRPmRNA-3’UTR存在与miRNA-302a结合的作用靶点；在乳腺癌耐药（MCF-7/MX-BCRP高表达）细胞中，转染miR-302amimic，构建miR-302a过表达的乳腺癌细胞模型；并由real-time检测和蛋白质印迹分析，确定miRNA-302a对BCRP的表达有负调节作用。
本实验证明，miRNA-302a通过直接调节BCRP的表达对在体和离体水平的乳腺癌细胞MCF-7/MX的耐药性进行调节。
结论
本实验证明，miRNA-302a通过直接与BCRPmRNA结合下调BCRP表达。
关键词
乳腺癌，microRNA,多药耐药，BCRP，LRP,P-gp，Mdr
·英文论著摘要·
InvestigationofmiR-302aregulatingmultidrugresistanceinbreastcancercells
Objective
Chemotherapyplaysanirreplaceableroleinthecomprehensivetreatmentofbreastcancer,butmultidrugresistanceintreatmentoftheseriousimpactontheclinicalcurativeeffectandtheprognosisofthepatients.BreastcancerresistanceproteinasanimportantABCtransporter,canthroughATPhydrolysisenergysupplytransportthesubstratefromthecellsagainstaconcentrationgradientpumptotheoutsideofthecell,causingthecellstodrugresistance,inducedresistance.RecentstudieshavefoundthatmiRNAplaysanimportantroleintheprocessofreversionofmultidrugresistanceoftumorcells.
Method
RealtimeRT-PCRdetectthedifferentexpressionofmiR-302aandlevelofBCRPmRNA;LuciferasereporterAnalysisobservetheexistencebindingsitesofmiR-302andBCRPmRNA;Westernblotdetectionresistanceproteinexpression.
Results
Analysisoftheexperimentaftertheluciferasereport,determinetheexistenceoftargetincombinationwithmiRNA-302ainBCRPmRNA-3'UTR,Inmultidrugresistantbreastcancercells,ransfectingmiR-302amimic,buildingmodelbreastcancercellmiR-302aexpression,anddetectedbyreal-timeandWesternblotanalysis,foundontheexpressionofmiRNA-302anegativelyregulatedBCRP.Theexperimentprovesthat,thedrugresistanceoftheinvivoandinvitroofMCF-7/MXbreastcancercellswereregulatedbymiRNA-302athroughdirectregulationofBCRPexpression.
Conclusion
miR-302aregulatetheexpressionofBCRPbycorelativingwithBCRPmRNA-3’UTR..
Keywords
Brestcancer，microRNA,multi-drugresistance，BCRPLRPP-gpMDR
·英文缩略语·
英文缩写
英文全称
中文全称
BCRP
breastcancerresistanceprotein
乳腺癌耐药蛋白
P-gp
P-glycoprotein
P糖蛋白
MRP
multidrugresistanceassociatedprotein
多药耐药相关蛋白
LRP
MDR
lungresistancerelatedprotein
multidrugresistance
肺耐药相关蛋白
多药耐药性
·论文·
miR-181a在乳腺癌多药耐药过程中的调控作用与机制研究
前言
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。
其治疗成功的最大障碍就是内源性和获得性的多药耐药性（multi-drugresistance，MDR）的产生。
因此，研究并发现能够有效增加乳腺癌细胞对药物敏感性的有效因子或手段，对于逆转乳腺癌细胞耐药性、提高临床治疗效果，具有重要意义。
乳腺癌耐药蛋白（breastcancerresistantprotein,BCRP）的表达与功能乳腺癌发生发展密切相关[1-3]，能够通过水解ATP供能将转运底物（化疗药物）从细胞内逆浓度梯度泵到细胞外【4,5】，特异性使乳腺癌细胞内米托蒽醌、拓扑替康、阿霉素、罗丹明123等浓度下降，从而导致细胞对药物抵抗、诱导耐药性产生【6-9】；而BCRP对其它耐药相关蛋白（如多药耐药蛋白（MRP）及P糖蛋白（P-gp））等的转运底物（如钙黄绿素及长春新碱、紫杉醇、维拉帕米等）无此外排作用【10,11】，可见乳腺癌细胞中BCRP功能不同于MRP、P-gp等其它多药耐药蛋白。
因此，靶向作用BCRP有效逆转乳腺癌耐药性的研究有待深入。
微小RNA（microRNA，miRNA）是长度约22nt的内源性短链RNA，在个体发育、细胞分化、增殖及凋亡等生理活动中、以及在肿瘤发生发展等病理过程中起重要调控作用【12-14】。
miRNA一般通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域（3’UTR）特异结合后，通过转录后调控（post-transcriptionalregulation）的方式抑制目的基因的翻译和表达【15】。
由于BCRPmRNA-3’UTR长度约为2kb，远长于人类mRNAs-3’UTR的平均长度700bp，提示BCRPmRNA-3’UTR可能存在miRNA调控BCRP表达的作用靶点。
可见miRNA靶向调控BCRP是深入研究乳腺癌耐药作用的重要切入点。
课题组采用miRNA芯片（microarrary）分析BCRP高/低表达乳腺癌组织和细胞的miRNAs表达谱，并通过Real-time-RT-PCR验证表达差异较显著的miRNAs,在MCF-7细胞及MCF-7/MX细胞的表达情况，在分析上述结果时课题组发现：
在差异显著的miRNAs中，miR-302a在BCRP高表达的MCF-7/MX耐药细胞中出现低表达，表明miR-302a可能与乳腺癌耐药细胞BCRP表达负相关。
目前miRNAs调控肿瘤细胞耐药性作用引起了学者的关注，但尚未见miR-302a控乳腺癌细胞耐药性及相关生物学行为等方面的研究报道。
为此，本研究以miRNA-302a作为切入点，构建miRNA-302a过表达乳腺癌细胞模型；在体外水平检测不同基因特性细胞生长表型、耐药性，分析miR-302a对乳腺癌细胞药物敏感性的影响及可能机制；明确miR-302a是否通过与BCRP的mRNA-3’UTR相互作用从而调控BCRP的表达；为发现乳腺癌耐药形成与逆转的新切入点和基因靶点提供理论与实验依据。
实验仪器材料
一.主要仪器：
超净工作台宁波新芝生物科技有限公司SC-15
高速台式冷冻离心机TGL-16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司
倒置荧光显微镜CCD成像系统日本OLYMPUS
智能型全温振荡器哈尔滨东联电子技术开发有限公司
-80℃深冻冰箱日本Thermo电子公司
流式细胞仪美国BDFACSCalibur公司
安图酶标仪17550型
电泳仪DYCZ-24DN型，北京市六一仪器厂
二.药品与试剂：
盐酸米托蒽醌（MX）、青霉素、链霉素；BCRP单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体、二抗；microRNA快速提取试剂盒；质粒小提中量试剂盒；膜蛋白提取试剂盒；荧光素酶报告分析试剂盒
实验方法
一.miRNA瞬时转染
乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/MX培养在六孔板（3×105个/孔）或100mm培养皿（2×106个）中，24小时后，用不含抗生素的无血清培养基饥饿培养1小时，之后分别转染miRNA-302amimic及其对照;4小时后，用新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基替换原培养基培养48小时，备用。
二.荧光素酶报告分析
本实验应用Luciferase荧光素酶报告分析，对miRNA-302a是否与BCRPmRNA-3’UTR有结合位点进行检测。
将pGL-BCRP3’UTR与miR-302amimic共转染入293T细胞48h后，荧光检测仪检测荧光强度。
实验最少重复三次，对结果进行统计分析。
三.Real-timePCR实验
取各实验组细胞和组织，按照microRNA快速提取试剂盒步骤，提取RNA，按10μl体系（DEPCH2O0.45μl，5*buffer2μl，RRI0.25μl，M-MLV0.3μl，RT-primmer1μl，dNTP1μl，RNA5μl）逆转录得cDNA，再按25μl体系（去离子水9μl，2*SYBRgreen12.5μl，Rox0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cDNA2μl）进行Real-timePCR实验。
实验最少重复三次，对miRNA-302a及BCRPmRNA在细胞内表达量进行统计分析。
四.western-blot分析
（一）BCA法测定细胞蛋白含量
1.蛋白标准曲线制备，配置体系及吸光度如下表：
表1，蛋白标准曲线配置体系及吸光度
样品号
蛋白量
标准溶液
0.5mg/ml
生理盐水
BCA
工作液
A570
1
0μg
0
20μl
200μl
0.102
2
0.5μg
1μl
19μl
200μl
0.128
3
1.0μg
2μl
18μl
200μl
0.165
4
2.0μg
4μl
16μl
200μl
0.214
5
4.0μg
8μl
12μl
200μl
0.312
6
6.0μg
12μl
8μl
200μl
0.398
7
8.0μg
16μl
4μl
200μl
0.486
8
10.0μg
20μl
0μl
200μl
0.599
2.打开酶标仪，预热30min，将波长设置为570nm；
3.用干净的96孔板，依次测定1-8孔的OD值；
4.绘制蛋白标准曲线：
计以标准蛋白含量为横坐标，在A570处的OD值为纵坐标做标准曲线。
图1，蛋白标准曲线
（二）细胞总蛋白提取
1.收集转染24h、48h后的各组6孔板中细胞，用预冷的PBS清洗细胞，弃净PBS液体；
2.加入150μl蛋白裂解液，冰上裂解20min，期间不断轻轻晃动使之裂解；
3.将细胞裂解液转移到1.5mlEP管中，4℃12000rpm离心10min；
4.小心用微量移液器将上清液（含有细胞总蛋白）转移到新的EP管中，-80℃保存备用；
5.根据标准曲线计算蛋白浓度。
（三）处理蛋白样品
用上样缓冲液处理蛋白样品，根据蛋白浓度定量，每孔上样量为25μl含50μg蛋白样品，用PBS补齐。
（四）.聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.用洗涤剂洗净玻璃板，去离子水冲洗后晾干，置于灌胶架上；
2.配置10%分离胶和5%浓缩胶，配方如下：
表2，10%分离胶和5%分离胶体系配方
10%分离胶
5%浓缩胶
ddH2O
7.9ml
4.1ml
30%丙烯酰胺
6.7ml
1.3ml
1.5mol/LTris-HCL
5.0ml
----
10%SDS
0.2ml
0.08ml
10%APS
0.2ml
0.08ml
TEMED
0.008ml
0.008ml
0.5mol/LTris-HCL
----
1ml
3.将配置好的分离胶小心灌注到两块玻璃板间隙内，立即加ddH2O封住胶表面，室温下聚合40min，至分离胶和水平面出现明显的分界线；
4.倾掉ddH2O，用滤纸吸干残留的ddH2O；
5.灌注浓缩胶至玻璃板的顶部，立即插入干净的梳子，室温聚合40min；
6.小心拔出梳子，用针头洗涤梳孔去除未聚合的丙烯酰胺，以便加入蛋白样品；
7.把灌好的凝胶固定到电泳装置上，槽中加入电泳缓冲液；
8.上样，每梳孔内加入蛋白样品（50μg）；
9.连接电泳装置，60V恒压，至溴酚蓝指示剂移至浓缩胶和分离胶的分界处，转为100V恒压，至溴酚蓝指示剂移至离凝胶底部1cm处，停止电泳，通过分离胶分离不同分子量的蛋白质；
10.电泳结束后，取下玻璃板，将凝胶取出放入转移缓冲液中。
（五）转膜
1.对照蛋白Maker，将含有目的条带和β-actin蛋白的凝胶切下，剪取相同大小的一块孔径为0.22μmPVDF膜，先用100%甲醇浸泡1min，再用去离子水浸泡3min，最后用转膜缓冲液浸泡15min；
2.剪取4块与凝胶相同大小的滤纸，转移缓冲液浸泡15min；
3.按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序组装三明治，每层都用玻璃棒将气泡赶出；
4.将三明治放入两块海绵之间，放在夹子上夹紧。
因为蛋白质带负电，注意PVDF膜在正极，凝胶在负极；
5.15V，4℃转膜过夜。
（六）封闭：
取出转膜后的PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5h。
（七）杂交：
1.用抗体稀释液按不同比例稀释一抗，加入到PVDF膜上，37℃孵育2h或4℃过夜；
2.二抗（HRP标记的抗鼠或抗兔IgG）根据一抗的来源确定，用封闭液按1：
1000稀释，37℃孵育lh。
PBST洗膜，10min×3次。
（八）显影
ECL成像系统发光显影，分析。
实验结果
一.检测MCF-7及MCF-7/MX细胞中miR-302a，BCRP的蛋白表达水平。
为了初步验证miR-302a与BCRP的相互作用关系，我们通过RealtimeRT-PCR检测了MCF-7及MCF-7/MX细胞中miR-302a与BCRPmRNA的表达水平，同时，用western-blot检测MCF-7及MCF-7/MX细胞中BCRP的蛋白表达水平，结果发现，与MCF-7细胞相比，MCF-7/MX细胞中miR-302a的表达水平明显降低，降低了50%（Fig1.A）。
而BCRP的蛋白表达水平，明显升高（Fig1.B）。
结果表明，miR-302a可能与BCRP的表达负相关。
图2， A,Realtime-PCR检测miR-302a在MCF-7与MCF-7/MX两细胞中表达差异；B,WeasternBlot检测两细胞中BCRP蛋白表达水平
二.荧光素酶报告基因分析检测miR-302a与BCRPmRNA-3’UTR的结合作用。
应用Luciferase荧光素酶报告分析进行检测miR-302a是否与BCRPmRNA-3’UTR有结合位点。
结果发现（见图2）：
在293T细胞中共转染miR-302amimic和pGL3-BCRP-3’UTR48h后，与转染NegativeControl（阴性对照）和pGL3-BCRP-3’UTR相比，酶活性分别下降31.5%，提示miR-302a与BCRPmRNA-3’UTR区存在直接结合位点。
图3，荧光素酶报告基因分析miR-302a靶向作用于BCRPmRNA-3’UTR区
三.miR-302a下调BCRPmRNA及蛋白表达水平
为了探讨miR-302a对BCRP的调控作用及可能的作用机制，转染miR-302amimic到MCF-7/MX细胞中，同步转染NCmimic作为阴性对照,转染后48h，通过Realtime-PCR检测BCRPmRNA表达差异，发现与阴性对照组相比，miR-302amimic转染组BCRPmRNA水平下降了29.6%；Westernblot检测BCRP的表达水平，结果显示，miR-302amimic转染组与阴性对照组相比，BCRP的表达也明显下调。
结果表明，miR-302a能够下调BCRPmRNA及蛋白表达。
B.
A.
图4.，Realtime-PCR检测MCF-7/MX细胞中转染miR-302amimic48h后，与阴性对照,转染后48h，BCRPmRNA表达的差异；B，Westernblot检测MCF-7/MX细胞中转染miR-302amimic48h后，与阴性对照相比，BCRP蛋白表达的差异。
实验讨论
5300多个人类基因已被认为是microRNAs（miRNAs）的靶基因，且miRNAs在个体发育、细胞分化、增殖、凋亡等生理活动中、以及在肿瘤发生发展等病理过程中起重要调控作用，提示miRNAs将成为诊断、治疗癌症的重要手段。
目前，少有研究阐述miRNAs在癌症多药耐药（MDR）发展中的作用，尚未见miRNA-302a调控乳腺癌细胞耐药性及相关生物学行为等方面的研究报道。
本研究中，我们的研究结果表明miR-302a参与调控了BCRP介导的乳腺癌多药耐药，进一步为研究阐明乳腺癌耐药作用的分子机制提供新思路，为发现有效逆转乳腺癌耐药的新型靶基因及作用位点提供理论与实验依据。
在MDR形成的众多机制中，耐药蛋白的表达是比较主要的机制，在多种肿瘤耐药的形成过程中都比较关键，其中MDR-1、MRP-1、LRP和BCRP作为主要的几种耐药相关蛋白，他们的表达水平成为预防与逆转多药耐药过程中的决定性因素。
然而，目前对于这几种耐药相关蛋白表达的调控机制尚不明确。
miRNAs作为很多基因的调控因子，近来有研究发现，miR-519c具有降低SI结肠癌细胞内源性BCRP转录及蛋白表达作用；转染miR-520h到前列腺癌PANC-1细胞后，可使细胞中BCRPmRNA和蛋白表达均下降，并可抑制细胞侵袭转移能力；miR-451和miR-27能够通过调控MDR-1/P-gp的表达增加肿瘤细胞的药物敏感性；miR-328在乳腺癌耐药细胞MC
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