高效广谱抗菌肽制剂的研制项目可行性研究报告.docx

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高效广谱抗菌肽制剂的研制项目可行性研究报告

高效广谱抗菌肽制剂的研制项目

可行性研究报告

一、选题的必要性

1、项目所处技术领域产业政策；

自从青霉素被发现以来，人们对病原菌引起的感染性疾病不再束手无策，特别是β-内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性疾病的治疗产生了革命性飞跃，抗生素已成为临床治疗病原菌感染的强有力武器。

但是，随着抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。

为了应对耐药菌感染，人们一方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌的耐药性，另一方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。

近年来出现的抗菌肽（antibacterialpeptides）就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，具有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素（peptideantibiotics）。

抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征（severeacutekespiratorysyndrome,SARS）病毒的作用。

因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域之一。

抗菌肽的抗菌机制与传统抗生素不同，传统抗生素是与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻，以达到抑菌或杀菌的作用，当抗生素作用的靶位点发生改变时，抗生素就会失去其抗菌作用，病原微生物往往通过基因突变改变抗生素靶位点而产生对抗生素有抗性的耐药菌株；抗菌肽对病原体的作用则完全是物理作用。

由于抗菌肽具有疏水和亲水的两亲性特征，通过其双亲性正电荷与细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在细胞的磷脂膜上，随后抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜的脂质膜中,进而造成细胞膜穿孔，使细胞质外溢而达到杀菌的目的。

由于抗菌肽与细菌细胞膜的结合不需要膜上特定的受体，因此不会诱导产生抗药菌株和交叉抗性，有望给临床医学、药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发应用前景。

鱼类生活在水环境中。

由于环境的破坏，自然水体和养殖水体污染日益严重，水体中病源微生物种类和含量在不断增加。

面对复杂的生存环境，鱼类在生存过程中需要不断地同大量的病原微生物作斗争。

但是，由于鱼类没有B或T淋巴细胞，体液因子中也没有免疫球蛋白的存在，在消灭入侵的微生物时，抗菌肽就起到了至关重要的作用。

因此，鱼类先天免疫系统中极有可能存在高效广谱的生物抗菌肽。

我们在前期工作中克隆了高效广谱的鱼类抗菌肽基因，本项目拟通过酵母表达获得抗菌肽，并将抗菌肽添加到饲料中，为日益严重的鱼类和畜禽病害防治开辟新的途径。

2、项目所处技术领域技术发展现状；

由于抗菌肽具有独特的抗菌机制，广谱的杀菌作用，高效的抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点，因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域之一。

计算机检索表明，国外的科学家作了大量的工作，对抗菌肽的研究已经取得了许多进展。

法国科学家蒂马克先生于1999年1月创建了Entomed公司，目的是尽可能得到不同类型的抗菌肽分子。

迄今国外科学家已在不同生物中发现了多种抗菌肽，我国在抗菌肽的研究方面起步较晚，仅有少量报道。

大量结果显示不同的抗菌肽其抗菌活性和抗菌谱存在很大的差异，因此继续寻找高效广谱的生物抗菌肽，是广大生命科学工作者努力的方向。

3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用；

本项目采用的是先进的分子生物学研究技术。

用基因克隆技术将我们从鱼肝脏中分离的抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体连接，构建重组DNA分子。

然后用醋酸锂法将重组DNA分子转入解脂耶氏酵母中，筛选高效表达抗菌肽的工程菌，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，进而开发出高效广谱的新型抗菌剂。

该项目的实施对相关领域技术进步有一定的推动作用。

4、项目目前进展情况。

我们已进行了前期工作，用引起人畜共患病的多种微生物诱导鱼，继而采用mRNA差异显示技术从经微生物诱导的鱼的肝脏中分离到了三个特异表达的mRNA分子，并使用RACE（rapidamplificationofcDNAends）-PCR技术克隆了它们的全长基因。

这些工作为本项目的实施奠定了基础。

二、技术方案论述

1、项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到的技术水平；

目前,人们主要以两种方法获得抗菌肽。

其一是直接从生物体内分离抗菌肽，用这种方法不能获得大量的抗菌肽。

其二是根据已发现的抗菌肽基因的序列设计引物在不同的生物中通过PCR技术克隆抗菌肽基因，该方法只能在不同生物中获得该抗菌肽的同源基因，而不能获得新的抗菌肽基因。

在本项目中，我们将前期工作中获得的抗菌肽基因与载体连接，构建抗菌肽酵母高效表达体系，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，用这种方法可获得大量新的高效广谱抗菌肽。

计算机检索结果表明，人们对昆虫抗菌肽进行了较多的研究，而对鱼类抗菌肽研究很少。

目前国内只有厦门大学最近采用传统方法从海水养殖的鲈鱼中分离出一种抗菌肽基因，但并未对该基因的表达及其产物的抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类抗菌肽基因的广谱抗菌肽制剂。

本项目将开发出具有自主知识产权的新型抗菌肽制剂。

项目完成时至少可达到国内领先水平。

2、项目技术方案论述：

生产技术、工艺流程、主要技术参数；

将采用RACE-PCR技术从鱼类克隆的抗菌肽全长基因与表达载体连接→构建重组载体→重组载体转入酵母→筛选抗菌肽高效表达酵母体系→大量表达抗菌肽→抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定→抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验

（1）重组表达载体的构建

将我们从淡水鱼中诱导表达的抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体连接，构建重组表达载体。

（2）抗菌肽基因酵母表达体系的构建及高效表达系统的筛选

①采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因酵母表达系统。

②采用Northernblot法和Westernblot法从转录和翻译两个水平上筛选抗菌肽高效表达酵母。

（3）抗菌肽的大量表达。

利用筛选到的高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。

（4）抗菌肽的分离纯化。

离心收集表达上清液,采用硫酸铵沉淀抗菌肽。

经SephadexG2100层析，收集各个洗脱峰,用15%的SDS-PAGE分析鉴定目的多肽所在的峰。

将含有目的多肽的洗脱液用PBS透析,冻干浓缩。

多肽于-70℃保存,用于分析鉴定及生物功能试验。

（5）抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。

采用琼脂扩散纸片法。

以大肠杆菌沙门氏菌,肠球菌、链球菌、分枝杆菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、梭状芽孢杆菌、李氏杆菌、巨大芽孢杆菌、醋酸钙不动杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链状球菌、流感病毒、疱疹病毒为受抑菌。

将大肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中,用玻璃刮铲将菌液涂布均匀,再将浸透被测样品液的滤纸片放在培养基的表面,标记后置于恒温箱中培养，观察抑菌效果,测定抑菌圈直径，了解抗菌肽的抗菌谱。

（6）将抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验。

3、项目技术质量指标：

项目产品达到的主要技术性能指标、执行的质量标准、通过的国家相关行业许可认证等；

（1）项目达到的目标

①构建出抗菌肽酵母高效表达体系，大量表达抗菌肽。

②研制出具有自主知识产权的高效广谱的抗菌肽制剂。

（2）考核指标

①该酵母表达体系对抗菌肽的表达稳定，表达量的重复性≥95%。

②抗菌肽的抗菌活性高，抗菌谱广。

4、分阶段描述项目执行过程中各阶段目标；

2007年

1-3月将抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体连接，构建重组表达载体。

4-6月将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因酵母表达系统。

7-9月筛选高效表达抗菌肽的酵母系统。

10-12月酵母发酵条件的优化。

2008年

1-3月采用发酵法生产抗菌肽。

4-6月抗菌肽的分离和纯化。

7-12月抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。

2009年

1-3月含抗菌肽饲料的配制。

4-9月动物实验。

10-12月课题总结鉴定。

5、项目经费预算情况：

项目投资总额、项目已完成投资、项目须新增投资及投资构成和投资预算、申请科技三项经费的使用预算（见附表）。

申请经费总额：

5万元。

其中：

仪器设备购置费0.5万元；材料、样品费0.5万元；试验费、检测费3.0万元；资料、调研费0.5万元；鉴定费0.5万元。

三、项目实施支撑条件

1、项目技术来源；

课题申请人在法国国家农业研究中心分子遗传学实验室工作期间，参加了欧盟资助的有关微生物抗菌肽在解脂耶氏酵母中表达的研究课题，掌握了抗菌肽研究的相关技术，为本课题的顺利完成奠定了技术基础。

2、项目实验、检测条件；

申请人所在实验室为江西省生物化学与分子生物学重点实验室，具有全自动DNA测序仪（ABIPrism3100型）、PharmaciaLKBmultiphor型电转仪、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰箱、PCR仪，Milli-Q超纯水系统、各种规格的电泳仪、杂交仪、紫外分光光度计、设施先进的细菌培养室等仪器设备。

上述仪器设备基本上可满足本项目的研究需要。

3、项目申请单位人才资源情况：

技术人员总数、中高级技术人员比例；

项目申请单位南昌大学是我省唯一一所省部共建的“211”工程重点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。

生命科学学院有专任教师150人，其中正副教授60人，讲师28人，中高级技术人员比例2:

1。

4、项目组人员专业结构、职称结构；

项目组科研人员8人，主要由生物化学与分子生物学专业、微生物学专业人员组成，专业结构合理。

科研人员中，教授2人、副教授1人、助教1人、研究生4人。

其中具有博士学位的教师2人。

5、项目新增投资筹集情况

本项目申请科研经费5万元。

四、项目预期经济效益

1、预期市场需求；

由于抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药菌株不断增加，对人类和动物的健康造成了严重威胁。

抗菌肽杀菌力强，抗菌谱广，不良反应少，不诱导产生耐药菌株，因此，必将成为今后抗菌药物的主导产品。

目前，国内还没有高效广谱抗菌肽产品面市，开发抗菌肽前景广阔。

2、预期盈利水平；

该技术的推广可产生明显的经济效益。

3、预期产业化前景；

本项目以现代生物技术方法研制具有较强的广谱抗菌能力的抗菌肽，并将其制成抗菌肽制剂。

研究成果的实用性强，易于转化。

在产品的研制工作中采用了现代分子生物学新技术，产品的科技含量高，生产成本低，利润空间大。

本产品的生产不需特殊大型设备，产品定型后可向中小型生化试剂生产企业转让，因此，本项目的产业化前景广阔。

我省具有一定生产能力的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品。

4、项目实施风险分析。

本项目从生活在病原菌含量高的水体中的鱼类中寻找动物内源性抗菌物质，以现代生物技术方法研制具有较强的广谱抗菌能力的抗菌肽，并将其替代抗生素作为新型饲料抗菌添加剂。

与传统抗生素相比，抗菌肽杀菌力强，抗菌谱广，而且不会诱导产生耐药菌株，因此具有强劲的市场竞争优势。

本产品为现代生物技术产品，技术含量高，生产成本底，投资风险小。

五、项目预计社会效益、环境效益

1、对社会发展的作用；

抗菌肽是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，具有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素。

抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征（severeacutekespiratorysyndrome,SARS）病毒的作用。

因此对社会发展具有重要的作用。

2、对资源利用情况；

以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。

工程菌发酵原料易得，不会破坏和浪费农业资源。

3、对人才培养情况；

本课题的实施将为我国培养4名生物化学和分子生物学及微生物学专业的硕士研究生。

4、环境影响及效益。

以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，在生产和推广应用过程中均不会影响生态环境。