注射用尤瑞克林效价测定方法评估论文.docx

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注射用尤瑞克林效价测定方法评估论文

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题目：

注射用尤瑞克林效价测定方法评估

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摘要

目的：

验证注射用尤瑞克林效价测定方法的精密度、线性、耐用性，以及考察该方法误差的主要来源。

方法精密度包括重复性和中间精密度：

以在规定范围内，至少用9个测定结果评估重复性，以不同日期不同实验员对同一个样品的检测评估中间精密度；同一个样品制备至少5个浓度测定，将结果进行线性回归，以相关系数评估方法的线性；以在规定的时间间隔内，反复测定同一个样品评估方法的耐用性。

结果吸光系数法的重复性实验结果RSD为0.60%，中间精密度实验RSD为2.08%，线性回归方程为：

y=0.9562x+0.0037（R2=0.9964）；结论吸光系数法测定注射用尤瑞克林活性的方法是可控的，但也存在一定的误差，本实验确定了误差主要来源酶促反应阶段。

[关键词]注射用尤瑞克林；效价；吸光系数法；紫外分光光度计；

ABSTPACT

0bjectiveToverifytheprecision、linearityandrobustnessoftheanalysismethodforassayofUrinaryKallidinogenaseforInjectionandevaluatetheoriginoftheerrors.MethodsPrecisionincludesrepeatabilityandintermediateprecision.RepeatabilityisevaluatedbytheRSDfrom9results,thedataisobtainedonthehigh、middleandlowconcentrationwiththesamesample,everyconcentrationtestfor3times;toevaluatetheintermediateprecisionwiththeRSDwhichthe9results,thedataisobtainedondifferentdays,anddifferentanalysts.Thelinearityisevaluatedbyrelatedcoefficient,whichfromthelinearregression,thedataisobtainedon5concentrationwiththesamesample;testthesamesampleattheprescriptivespaceoftime,toevaluatetherobustness.ResulttheRSDofrepetitivenessis0.60%theRSDofintermediateprecisionis2.08%theregressionequationoflinearityisy=0.9562x+0.0037（R2=0.9964）,Therearenotanysignificancedifferencebetweenbeforeandafteraddingcontrast.ConclusionTheanalysismethodforassayofUrinaryKallidinogenaseisfeasible,buttherearestillsameerrors.Afterthisexperiment,wecanmakesurethattheoriginoftheerrorsfromtheenzymaticreaction.

[Keywords]UrinaryKallidinogenaseforInjection;Activity;Themethodsofabsorptioncoefficient;Ultravioletspectrophotometer

目录

前言部分…………………………………………………………………………………03

文献研究…………………………………………………………………………………04

1酶促反应………………………………………………………………………………04

1.1温度…………………………………………………………………………………04

1.2底物与酶的浓度……………………………………………………………………05

1.3pH……………………………………………………………………………………05

2紫外分光光度计的影响………………………………………………………………05

2.1仪器…………………………………………………………………………………05

2.2测定条件……………………………………………………………………………06

实验部分…………………………………………………………………………………07

1实验原理………………………………………………………………………………07

2实验方法………………………………………………………………………………07

2.1仪器与试药…………………………………………………………………………07

2.1.1仪器………………………………………………………………………………07

2.1.2试药………………………………………………………………………………07

2.2溶液的配制…………………………………………………………………………07

2.2.1缓冲液……………………………………………………………………………07

2.2.2底物溶液…………………………………………………………………………08

2.2.3样品溶液…………………………………………………………………………08

2.2.4反应终止液………………………………………………………………………08

2.3吸光系数法…………………………………………………………………………08

2.3.1测定法……………………………………………………………………………08

2.3.2精密度实验………………………………………………………………………08

2.3.2.1重复性实验……………………………………………………………………08

2.3.2.2中间精密度实验………………………………………………………………09

2.3.3线性实验…………………………………………………………………………09

2.3.4耐用性实验………………………………………………………………………09

3实验结果………………………………………………………………………………09

3.1吸光系数法…………………………………………………………………………09

3.1.1精密度实验………………………………………………………………………09

3.1.1.1重复性试验……………………………………………………………………09

3.1.1.2中间精密度实验………………………………………………………………09

3.1.2线性实验…………………………………………………………………………10

3.1.3耐用性试验………………………………………………………………………10

4实验结论………………………………………………………………………………11

5讨论……………………………………………………………………………………11

参考文献…………………………………………………………………………………12

致谢………………………………………………………………………………………12

前言部分

尤瑞克林主要成分为人尿激肽原酶，是自新鲜人尿液中提取精制的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，能将激肽原转化为激肽（kinin）和血管紧张素（kallidin）。

体外研究显示，该药对离体动脉有舒张作用，并可抑制血小板聚集、增强红细胞变形能力和氧解离能力。

尤瑞克林能水解特定的底物——S-2266（H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl,一种长的肽链），使其肽链发生断裂，其中一种水解产物是对硝基苯胺（PNA），反应机理如下：

H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl

复合物+PNA

尤瑞克林的酶活力测定就是通过测定产生对硝基苯胺的量来实现的。

效价单位为PNAU，在37±0.5℃，pH8.0的条件下，一分钟内水解S-2266产生1μmol对硝基苯胺即为1PNAU。

根据对硝基苯胺在可见光区有吸收，可以照分光光度法（中国药典2010版第二部ⅣA），在405nm波长测定吸光度，以郎伯-比尔定律计算对硝基苯胺的浓度，得出尤瑞克林的效价。

文献研究

紫外分光光度法测定酶活性的影响因素

紫外—分光光度法的基本原理是Lambert-Beer定律。

表示为A=ECl（或A=εCl），用于单组份样品的含量测定主要有包括吸光系数法，标准曲线法和标准对照法。

[1]

紫外—可见分光光度法是测定酶制品含量是一种常见的方法。

例如常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶、血清血管紧张素转换酶ACE等。

[2][3]这些酶大多是与底物发生酶促反应后生成有颜色的物质，在紫外光或可见光下有吸收，在特定的条件下，用紫外-可见分光光光度法可以定量测定生成的物质的含量，从而得到酶的含量。

人尿激肽原酶（hk-1），又称人尿激肽释放酶。

其活性测定的方法在参考日本方法的基础上加以改进，采用的空白管是以抑肽酶抑制hk-1的活性，样品管则按顺序加入缓冲，样品，底物，终止液，而空白管则是抑肽酶溶液，样品，底物，终止液，反应终止后，在405nm，用空白管调零，测定样品管的吸光度，采用吸收系数法进行计算。

[4][5]

紫外分光光度法测定酶活性的误差来源主要有两个方面。

一个是酶促反应的条件控制。

由于酶促反应是一类生化反应，与一般的化学反应相比，反应条件较难控制，影响因素诸多，如温度、pH值、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂等。

另一个是紫外分光光度计的性能以及测定时的环境因素等。

１　酶促反应条件

1.1　温度

在温度较低时，反应速度随温度的升高而加快。

但温度超过一定数值后，酶作为一种蛋白质，会受热变性，反应速度减慢。

于是，形成倒U形曲线。

在达到此曲线顶点所代表的温度时，反应速度最快，即为酶的最适温度。

下图为温度对唾液淀粉酶活性影响。

不同温度下，加入酶后反应不同时间的吸光度不同，在一定温度范围内，酶反应温度越高，所测得的酶活力会增加，温度增加，温度系数略有降低，意味着对测定结果影响减弱。

所以在酶促反映允许的范围内升高温度，可以提高测定结果的准确性。

由于大多数酶促反应的最佳温度为37°C，所以，在一般情况下，实验设计时，会将37°C作为一个中间的温度值，再测定高于或低于此温度下的酶活力，以求得最佳反应温度。

[6][7]

温度的影响对不同的酶影响的大小不同。

弹性酶分别在10±1°C与28±2°C条件下测定效价，t检验结果为7.192，t＞t（9）0.01,P＜0.01表明测得的弹性酶片的效价差有非常显著的差异；而在10±1°C与20±1°C时，t测验结果为0．276，t＜t（18）0.05,P＞0.05表明在10±1°C与20±1°C条件下测得的两组弹性酶片的效价值之间无显著差别。

[8]

1.2　底物与酶的浓度

在一定范围内，保持酶的浓度不变，当底物的浓度很小时，增加底物的浓度，酶促反应速度随着增加，当底物的含量达到一定浓度时，反应速度不再发生变化，证明酶被底物饱和。

可以以此判断该浓度为酶促反应的最佳浓度。

为了保证最大限度地发挥酶的水解作用，酶促反应通常要求底物是略过量的，下图为底物浓度对反应初速度的影响。

沙雷肽酶活性测定的底物为酪蛋白，配制酪蛋白底物浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.75%、0.8%、和1.0%的溶液。

酶的浓度为13μl／ml，按实验方法操作并绘图．以下为示意图：

如图所示所示，底物浓度在0.4%～0.8%吸收度无变化，故选底物浓度为0.6%.[9]

1.3　pH

酶促反应受酸碱值的影响明显。

只有在特定的pH值条件下，酶、底物和辅酶的解离情况，才最适宜于它们的相互结合，并发生催化作用，使酶促反应速度达到最大值，这种pH称为最适pH。

动物体内多数酶的最适pH值接近中性。

但最适pH值不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类和浓度以及酶的纯度等因素影响。

下图为酶最适pH的示意图。

[10]

2　紫外分光光度计的影响

吸光系数法直接利用公式，需要知道吸光系数ε或E，通常这种方法也叫绝对法。

但是这种方法不是任何情况下都适用的，必须要求仪器固定，仪器的单色光纯，工作状态和测定条件固定。

否则将产生较大的误差。

[1]

2.1　仪器

从理论上说，用光吸收定律测量溶液浓度时，入射光应该是一束根据被测物质光谱特性选择的特定波长的单色光，而实际上仪器所能提供的入射光既与单色器的种类有关，又与单色器的性能有关。

分光光度计提供的入射光实质是具有一定带宽的单峰曲线。

此类单峰曲线和理论上的单色光是有区别的，原则上所有单色光是得不到的，由此造成的误差是影响仪器测量准确度的主要因素。

[11]

由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，波长的变动会引起吸收系数的不准确，所以每次测定前应校正测定波长。

[12]另外杂散光、散射光、反射光和非平行光都会从不同角度使仪器偏离郎伯-比尔定律，致使实验结果产生误差。

2.2　测定条件

紫外分光光度计的性能还受测定时的环境因素的影响。

来自仪器的噪音，使透光率测量发生误差。

另外，还有温度的影响，通常要求紫外分光光度计在固定的实验台放置，并配置有恒温箱，可以保证测定时的温度恒定。

综上所述,要减少紫外分光光度法测定酶活性的误差,可以从以下方面考虑:

控制酶促反应的温度在恒定水平、最佳的底物与酶的浓度、在最适pH、固定的反应时间、精密的仪器、可控的测定环境等。

实验部分

1.实验原理

1.1　尤瑞克林是一种蛋白水解酶，这里就涉及到酶活性单位的定义。

酶活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。

根据国际生化学会酶学委员会规定：

在特定的条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的量为一个国际单位（IU），即1IU=1μmol/min。

[13]

尤瑞克林主要成分为人尿激肽原酶，是自新鲜人尿液中提取精制的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，能将激肽原转化为激肽（kinin）和血管紧张素（kallidin）。

尤瑞克林能水解特定的底物——S-2266，使其肽链发生断裂，其中一种水解产物是对硝基苯胺。

尤瑞克林的效价单位就是通过对硝基苯胺来表示的。

定义为37℃、pH8.0的条件下，1分钟内催化水解底物S-2266而产生1μmol对硝基苯胺的量为1PNA单位，表示为1PNAU。

所以可通过检测对硝基苯胺的含量从而得到尤瑞克林的效价。

对硝基苯胺为一种黄色的物质，颜色的深浅与尤瑞克林活性呈正比关系，通过检测405nm处的吸光度，即可求出尤瑞克林的活性。

1.2　精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

通常用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

[14]

1.3　线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

[14]

1.4　耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。

[14]

1.5　在吸收系数法的基础上引入对照物质，可以减少仪器测定时引入的误差，通过对比引入对照前后测定结果的差异，可以评估紫外分光光度计对本实验误差产生的影响。

[14]

2　实验方法

2.1　仪器与试药

2.1.1　仪器

紫外分光光度计（型号：

UV1240；厂家：

岛津，日本；检定有效期：

2013-11-14）

恒温水浴箱（型号：

ISOTEMP210规格：

厂家：

Polysience，USA；检定有效期：

2014-01-28）

分析天平（型号：

SartoriusBP211D；规格：

十万分之一；厂家：

Sartorius；检定有效期：

2013-12-04）

移液器（规格：

100-1000μl/20-200μl编号：

18012324/210231298厂家：

SOCORES;检定有效期：

2014-01-31/2013-03-29）

2.1.2　试药

注射用尤瑞克林（批号：

311205021；规格：

0.15PNAU/支，粉针剂；来源：

广东天普生化医药股份有限公司）

底物（S-2266）（批号：

N0821230；规格：

25mg/支；来源：

CHROMOGENIX）

三羟甲基氨基甲烷（批号：

090215来源：

上海源聚生物科技有限公司）

冰醋酸（批号：

20121109-2来源：

广州化学试剂厂）

2.2　溶液的配置

2.2.1　缓冲液

称取三羟甲基氨基甲烷24.4g，加纯化水800ml溶解，用6mol/L盐酸溶液调节pH至8.0，加水至1000ml，混匀，即得。

2.2.2　底物溶液

拿一支S-2266，加水14.4ml溶解，作为贮备液，临用前用水稀释一倍。

2.2.3　样品溶液

拿一支注射用KN，加缓冲液1ml使其充分溶解后，再取出0.2ml，加缓冲液至1ml，混匀即得。

理论效价为0.03PNAU/ml。

2.2.4　反应终止液

50%醋酸溶液：

量取冰醋酸50ml，加水至100ml，混匀即得。

2.3　吸光系数法

2.3.1　测定法

取试管四支，其中空白管一支，样品管三支。

按表1操作：

表1

加入物

空白管

样品管

供试品（ml）

0.2

0.2

0.2mol/LTris缓冲液（pH8.0）（ml）

4.0

4.0

立即计时37±0.5℃水浴准确保温5min

50%醋酸溶液（ml）

0.4

—

底物溶液（ml）

—

0.4

混匀，立即计时，37±0.5℃水浴准确保温15min

底物溶液（ml）

0.4

—

50%醋酸溶液（ml）

—

0.4

用空白管调零，在405nm波长处检测吸光度。

计算：

按下式计算每支供试品中尤瑞克林的单位数

PNAU/支=

A：

供试品在405nm处吸光度

T：

稀释倍数

F：

反应常数为173.6。

（F=

106：

变换系数（mol→μmol）；V：

总反应液，即5ml；v：

样品溶液，即0.2ml；9600：

对硝基苯胺在405nm处的吸光系数；t：

反应时间，即15min。

）[15]

2.3.2　精密度实验

2.3.2.1　重复性实验

分别配（0.0345PNAU/ml）、中（0.03PNAU/ml）、低（0.027PNAU/ml）三个浓度的供试品溶液，按照2.3.1测定法项下的操作测定活性；每个浓度重复测定3次，共测定9次，计算其平均值及相对标准偏差。

2.3.2.2　中间精密度实验

在同一个实验室内采用三个实验员对同一批样品的同一个浓度在不同时间内共测定三次，作为中间精密度的结果。

取样品，稀释成0.03PNAU/ml,按照2.3.1测定法项下的操作测定活性，共测定9次，求出平均值以及相对标准偏差。

2.3.3　线性实验

将样品配置成0.0135、0，027、0.03、0.0345、0.069PNAU/ml五个浓度，分别按照2.3.1测定项下测定每一个浓度的实测活性，以测得的响应信号作为被测物质浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归，以相关系数评估线性。

2.3.4　耐用性实验

将反应结束后的待测溶液放入紫外分光光度计的测量池中，每隔30min测定一次吸光度值，观察吸光度的变化。

评估待测溶液随放置时间的延长的变化情况。

3　实验结果

3.1　吸光系数法

3.1.1　精密度实验

3.1.1.1　重复性实验

平均为0.167PNAU/支，RSD=0.6%，重复性良好。

数据与结果如下：

表2.效价计算

0.027PNAU/ml

0.03PNAU/ml

0.0345PNAU/ml

第1次（PNAU/支）

0.1670

0.1700

0.1660

第2次（PNAU/支）

0.1680

0.1700

0.1640

第3次（PNAU/支）

0.1670

0.1680

0.1660

测定平均值（PNAU/支）

0.1670

0.1690

0.1650

SD

0.0006

0.0012

0.0012

RSD%

0.36%

0.71%

0.73%

3.1.1.2　中间精密度实验

平均为0.164PNAU/支，RSD为2.08%。

数据与结果如下：

表3.效价计算

操作者

日期

实测效价

效价平均值

SD

RSD

PNAU/支

PNAU/支

PNAU/支

2013/1/2

0.166

0.163

0.003

1.88%

詹金陶

2013/1/2

0.16

2013/1/8

0.162

2013/1/2

0.161

0.162

0.006

3.76%

潘艳宜

2013/1/2

0.157

2013/1/8

0.169

2013/1/2

0.166

0.167

0.001

0.60%

张容平

2013/1/2

0.167

2013/1/8

0.168

3.1.2　线性实验

线性回归方程：

y=0.9562x+0.0037（R2=0.9964），数据与结果如下：

表4.效价计算

供试品浓度（PNAU/ml）

测定值（PNAU/ml）

0.0135

0.0149

0.0270

0.0300

0.0300

0.0336

0.0345

0.0373

0.069

0.0689

3.1.3　耐用性实验

在反应结束后的2个小时内，稳定性良好，其变化如下图：

4　实验结论

4.1　吸光系数法测定注射用尤瑞克林效价，重复性RSD为0.60%，中间精密度RSD为2.08%，精密度良好；线性、耐用性均达到要求，结果证明本方法是可控的。

4.2　但从重复性和中间精密度的结果对比可以看出，由同一实验员在同一时间测定的结果的变异系数较小，而不同实验员或在不同时间内，即便是同一台仪器，同样的样品，测定的结果的变异系数较大，说明本方法确实存在一定的误差。

经过分析，认为误差的来源可能有两个方面，一是在酶促反应的条件控制，一是反映结束后的仪器测定过程。

4.3　通过对比引入对硝基苯胺前后的精密度、线性、耐用性，发现两种方法的结果并无显著性差异。

说明误差的主要来源不是反应结束后的测定阶段，也就是紫外分光光度计和反应后的测定温度、放置时间等对本实验的影响不大。

而误差的主要来源于对酶促反应的条件控制。

5　讨论

5.1　本实验样品为一种酶制品，与底物发生的酶促反应，实验过程比普通的化学反应要复杂，所以在反应过程中可能引入误差的因素也较多。

对酶促反应影响较大的环境因素包括反应体系的温度，酸碱度，反应时间；非环境因素，如底物与样品的浓度等。

正是因为酶促反应的复