酶的抑制及其动力学次.ppt

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第十章酶的抑制及其动力学,第一节抑制作用及其分类,一概念:

广义上说，凡是阻碍或降低酶促反应速度的作用称为抑制作用。

1.钝化或变性作用（inactivationordenaturation）指酶蛋白受物理或化学因素的影响，部分或全部改变酶的空间构像从而引起酶活性降低甚至丧失的现象。

根据除去致变性因素后，酶活性是否可以恢复，变性作用分为可逆和不可逆作用。

特点:

变性后酶蛋白构象发生变化，但肽键不断裂,2抑制作用（inhibition）指酶的必需基团受某种化学物质的影响而被改变，导致酶活性降低或失活。

特点:

抑制剂部分或全部接到功能基上或基团的性质发生改变。

但酶蛋白并未变性。

3去激活作用加入金属鳌合剂后，去除金属离子结合，使酶活性降低。

二抑制程度,以反应速度的变化来衡量：

1相对活力分数（残余活力分数）：

a=ViV02抑制常数（抑制率）：

i=1-a=1-ViV0三抑制作用的分类：

1.不可逆抑制:

抑制剂与酶的某些必须基团以共价键形式结合，其抑制剂不能以物理（超滤、透析、电泳）方法除去。

2.可逆抑制:

抑制剂与酶的某些必须基团以非共价键结合可用物理法除去。

（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别*物理方法处理：

透析，超滤，凝胶过滤；*动力学方法：

取不同量的酶加到含有等量S和I的等体积反应体系中，测定反应初速度，以vE作图将酶与抑制剂预保温后，取不同量混合液加到含有等量S的等体积反应体系中，测定初反应速度，以vE作图,v,v=k2SE0Km+S,v,无,不可逆,可逆,v=kE0,第二节不可逆抑制作用机理,一非专一性不可逆抑制剂:

非专一性不可逆抑制剂作用于酶分子中的几类基团酰化试剂:

-SH磺酰氯-NH2D（I）FP+E-OH酰化酸酐类-酚羟基烷化剂:

一般含有活泼的卤素基团。

-OH碘代乙酸-COOHR-XFDNB+E-SH烷化溴乙酸-咪唑基-S-CH3,金属酶抑制剂：

能与金属形成络合物，毒害以金属离子为活性中心的金属酶。

如氰化物、硫化物、叠氮化物和CO等重金属毒物：

重金属盐类，包括Hg、Pb、Ag、Cu等为蛋白沉淀剂；或作用于含SH的酶有机汞，有机砷化合物：

作用于酶分子中的Cys巯基，如：

路易斯毒气（Lewisite）；解毒（BAL，即二巯基丙醇）青霉素（Penicillin）：

作用于糖肽转肽酶（glycopeptidetranspeptidase）的Ser羟基,氧化剂：

包括一些弱氧化剂或光敏剂过甲酸-咪唑基光敏剂+E-SH氧化四硫硫酸钠-OH还原剂:

-S-S-含-SH化合物2-SH其它修饰剂：

重氮化、硝化、酯化等注意：

酰化试剂或烷化剂等一般全部或部分以共价方式结合到酶上；但氧化剂或还原剂是改变或修饰基团的性质。

二专一性不可逆抑制,

（一）Ks型：

是根据底物的化学结构设计的，是酶的底物类似物，可被酶结合但不能被酶作用，分子中含活泼基团，可修饰酶的必需基团。

E+SESE-IKs抑制剂的专一性，取决于抑制剂与活性中心必需基团，以及与活性中心之外同类基团形成非共价络合物的解离常数之比：

只有Ks中心/Ks非中心10-3才有应用价值亲和标记试剂TLCK（对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮，胰酶抑制剂）TPCK（对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮，胰凝乳酶抑制剂）,

（二）Kcat型（又称自杀性底物）根据酶的作用机理设计的，不仅结构和底物类似，且是酶的天然底物，可被酶结合和催化。

其中含一个潜伏性基团，由于酶的催化而暴露或活化，从而集中攻击酶的活性中心。

又称酶的自杀性底物（Suicidalsubstrate）E+SiKsESiKcatEIKiE-IKs:

ESi的解离常数；Kcat：

ESi转化为EI的催化常数抑制作用的关键取决于Kcat，Kcat越高抑制程度高,Kcat型抑制剂比Ks具有更高的专一性：

Kcat型抑制剂是酶的底物，不仅被酶结合，而且能被酶催化。

可区分具有相同底物，但催化机制不同的酶Kcat型抑制剂只能形成于酶反应中心，因而专一性攻击酶活性中心基团。

例如某些机磷农药：

敌敌畏、敌百虫、乐果等（RO）2-P-XO（S）,O2N-O-POC2H5肝氧化酶O2N-O-POC2H5SOC2H5OOC2H5（对硫磷）胆碱酯酶（对氧磷）KsO2N-O-POC2H5OOC2H5,（磷酸化胆碱酯酶）,第三节可逆抑制作用动力学,一四种基本动力学类型：

1.竞争性抑制：

E+SK1ESK2E+P+K-1IEK1SESKiK-iK-1EIKiIK-iEI,EI:

E:

ES:

V=k2ES=k2ESE0=k2E0Sk-1+k2（1+kiI）+Sk1k-iVm=k2E0Ki=k-ikiKm=k-1+k2k1V=VmS=VmSKm（1+I）+SKm+SKi动力学常数的求取：

1=1+Km（1+I）1VVmVmKiS相交于纵轴一点，Vm不变；Km增大,I,抑制率：

VmSkm（1+I/ki）+SI/Kii=1-a=1Vi/V0=1-VmS=1+I/ki+S/Kmkm+S若I不变，抑制率i与S成反比；若S，i=0即：

底物量极大时，可解除竞争性抑制注意:

过渡态类似物：

酰苷五磷酸（AP5A）为腺苷激酶过渡态底物类似物：

ATP+AMP2ADP某些竞争性抑制剂并不是底物的结构类似物。

如：

水杨酸是NADH为辅酶的脱氢酶或以ATP为底物的肌酸激酶的竞争性抑制剂，但结构与NADH或ATP不同,竞争性抑制的特点：

阻碍底物与游离酶结合，具有竞争关系竞争性抑制剂可以是底物的基态类似物、过渡态类似物或其它非底物结构类似物。

双倒数作图相交于纵轴一点Vm不变；Km增大抑制率i与S成反比；若S，i=0,2.非竞争性抑制：

E+SK1ESK2E+P+K-1+IIKiK-iKiK-iEI+SK1ESIK-1特点：

底物与抑制剂在与酶结合的过程中互不干扰四个解离常数:

Ks=K-1=K-1=ksK1K1Ki=K-i=K-i=KiKiKi,n=4m=5用迅速平衡理论：

K2K-1可忽略ESE+P则n=4m=4,V=K2ES=K2ESE0=Vm/（1+I/Ki）S令Km=KsKs+SV=Vm/（1+I/Ki）SKm+S双倒数图：

1=1（1+I/Ki）+Km（1+I）1VVmVmKiS图像相交于横轴一点，Km不变，Vm减小,1/S,-1/Km,1/V,1/Vm,1/Vm,I,抑制率：

i=1Vi/V0=11+Ki/I讨论：

非竞争抑制中i与底物浓度无关，不能通过增加S，来解除抑制。

若I升高,则i增加，若I，i=100%,非竞争性抑制的特点：

抑制剂可与E或ES复合物结合，底物、抑制剂与酶的结合互不干扰（Ks=KS;Ki=Ki）双倒数作图相交于横轴一点Km不变；Vm减小抑制率i与S无关，不能通过增加S来解除抑制。

3反竞争抑制:

E+SK1ESE2E+PK-1+Ik-ikiESI特点:

抑制剂只能和酶与底物的复合物结合，而不能单独与酶结合。

V=Vm/（1+I/Ki）S=VmSKm/（1+I/Ki）+SKm+SVm和Km都减少，但Vm/Km=Vm/Km,动力学常数的求取：

1=1（1+I/Ki）+Km1VVmVmS得到一组平行线抑制率：

i=11+（1+KmS）KiI若I一定，则i与S成正比；若S，抑制率达到最大,此时：

imax=I/（Ki+I）S一定，则i与I成正比,I，i=100%,I,反竞争性抑制的特点：

抑制剂只能与ES复合物结合双倒数作图为一组平行线Km和Vm都减小，但减小的比例相同抑制率i与S成正比，增加S反而将增强抑制。

4.混合型抑制：

若S，I与酶的结合彼此间有一定的干扰，即KsKs；KiKi，则为混合型抑制。

E+SK1ESK2E+P+K-1+IIKiK-iKiK-iEI+SK1ESIK-1反应历程和处理方法同非竞争性抑制,Vm和Km都变化,动力学常数求取：

1=Km1（1+I/Ki）+1（1+I/Ki）VVmSVm交点坐标：

（KiKm）,非竞争+竞争抑制非竞争+反竞争抑制I对E的亲和力高于ESI对ES的亲和力高于E,I,混合型抑制的特点：

抑制剂可与E或ES复合物结合，底物、抑制剂与酶的结合并非互不干扰（KsKs;KiKi）双倒数作图相交于第二或第三象限一点，Km、Vm都减小，但比例不同抑制率:

i=1-vi/v0=Km+S1+1（Km/Ki+S/Ki）/I,四种基本动力学的关系：

Ki，竞争性抑制，Km=Km（1+IKi）Vm=VmKi，反竞争性抑制，Km=Km（1+IKi）Vm=Vm（1+IKi）Ki=Ki，非竞争性抑制，Km=KmVm=Vm（1+IKi）KiKi，KiKi非竞争+反竞争KiKi非竞争+竞争混合型抑制是四种基本动力学总方程,二抑制常数的Ki（Ki）求取:

（一）计算法：

双倒数作图+计算加入单一固定浓度的I，测定反应初速度v与S的关系，双倒数作图得一直线。

其斜率或纵截距与无I时的直线之比，除少数外，一般为1+I/Ki或1+I/Ki，带入I可求取Ki或Ki。

竞争性抑制：

斜率之比=1+I/Ki；纵截距之比=1非竞争性抑制：

斜率之比=纵截距之比=1+I/Ki反竞争性抑制：

斜率之比=1；纵截距之比=1+I/Ki混合型抑制：

斜率之比=1+I/Ki；纵截距之比=1+I/Ki优点：

简便快速缺点：

误差较大,

（二）Dixon作图法（1/VI）:

Dixon作图法：

将S固定在不同的浓度，求每一个S下V0与I的关系，然后以1/V对I作图得一组直线，直线交点的横坐标为Ki值。

设底物浓度为S1时，反应初速度为V1；底物浓度为S2时，为V2，并且S1S2则各种可逆抑制时的动力学常数求取如下：

竞争性抑制：

1=1+Km（1+IKi）1VVmVmS1-1=Km（1+IKi）1-（1+IKi）1V1V2VmS1S2若两直线有交点，则应有:

1/V1=1/V21-1=-I（1-1）S1S2KiS1S2I=-Ki即：

交点的横坐标为-Ki,非竞争性抑制：

1=1（1+I）+Km（1+I）1VVmKiVmKiSI=-Ki反竞争性抑制：

1=Km1+1（1+I）VVmSVmKi以Dixon法得到一组平线所以，无法求得Ki值。

混合型抑制：

1=Km1（1+I/Ki）+1（1+I/Ki）VVmSVm注意：

Dixion作图法求取的是Ki值，而不能得到Ki值。

（三）Cornish-Bowden作图法（S/VI）：

在双倒数方程两侧乘以S，再以S/VI作图，所得直线相交于一点，交点横坐标为-Ki。

反竞争性抑制：

1=Km1+1（1+I）VVmSVmKi方程两侧乘以S，得：

S=Km+S（1+I）VVmVmKiS1-S2=S1（1+I）-S2（1+I）=0,I=-KiV1V2VmKiVmKi,混合型抑制：

S=S（1+I/Ki）+Km（1+I/Ki）VVmVm当S1/V1=S2/V2时，I=-KiCornish-Bowden作图法求取的是Ki值.,三其他类型的可逆抑制:

（一）部分抑制（partialinhibition）:

完全抑制：

EI或ESI为死端产物,I,i=100%部分抑制：

ESI部分分解E+I+P,I,i100%部分反竞争抑制:

E+SESk2E+P+IESIk2E+P+I,k2k2,部分非竞争性抑制:

E+SKsESk2E+P+IIKiKsKiEI+SESIk2E+P+I部分混合型抑制：

k2k2KsKsKiKi部分竞争性抑制：

有少量ESI形成，但k2=k2,KiKi,KsKs当S可减缓抑制，Vm不变，K