RTPCR sop.docx

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RTPCRsop

RT-PCR实验步骤

一、实验器具与材料：

1、移液枪：

1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头：

1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：

5ml

4、吸头台：

放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、EP管：

1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶：

2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）

1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）

7、量筒：

50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：

250ml、500ml、1000ml

9、试管架：

5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶：

250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

11、铝制饭盒：

4个

12、塑料小饭盒：

1个

13、大瓷缸：

2个

14、锡泊纸：

一卷

15、卷纸：

2卷

16、三角烧瓶：

带盖，稍大

二、实验器具的处理与准备

1、塑料制品：

（包括枪头、EP管、匀浆管等）

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）

2、玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）

3、匀浆器：

（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）

三、试剂配制：

1、DEPC水：

吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：

用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）

3、异丙醇：

放入棕色瓶中

4、氯仿：

放入棕色瓶中

5、琼脂糖

四、几种缓冲液的配制：

1、电泳缓冲液：

Tris54g

硼酸27.5g

0.5MEDTA20ml？

pH8.0

蒸溜水1000ml

5×TBE（贮存液）

再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液

2、上样缓冲液：

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF

30%甘油

6×缓冲液，4℃保存

五、琼脂糖凝胶的配制：

1、1.0%：

1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。

2、1.5%:

同上，将琼脂糖的量改为1.5g

六、需购置的Rt-PCR材料：

（生工.Tel.2236106.）

Taq酶（含MgCl2Buffer）200u70.00

dNTP:

1支

oligo（dT）15:

1OD40.00promega

M-MLV:

1支250.00promega（Buffer）

RNasin:

1支110

——-20℃

DEPC5g110.00

Trizol100ml/1瓶InvitrogenLifetechnologies

——4℃

Marker:

10μg0.2μg/ml150.00科威

（1543.994.697.515.377.231）

七、引物合成

1、内参照：

GAPDH

正义：

5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′

反义：

5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′

β-actin

正义：

5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′

反义：

5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′

2、par-4:

正义：

5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′

反义：

5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′

3、退火温度计算

2（A+T）+4（G+C）

正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）

4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好

5、引物稀释：

加DEPC水量为（μl）

=?

nmol/OD×管上所标OD数×100

是为10pmol/μl浓度的引物溶液

八、PCR产物电泳

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。

九、几个注意点：

1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？

2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。

3、RNA抽提前，打开离心机预冷。

TRIzol法抽提总RNA

细胞1×107

组织100mg

↓

加1mlTRIzol

细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

↓

匀浆（要彻底，后转至EP管）

（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

4℃，离心12000g，15分钟

↓

转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中

↓

加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟

↓

4℃，离心12000g，10分钟

↓

弃上清

↓

加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml

↓

4℃离心7500g，5分钟

↓

弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）

↓

溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）

（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

注：

1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解

2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）

3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年

两步法RT-PCR

（第一步：

逆转录反应）

试剂浓度体积终浓度

RNA23μl（11.5μl）

Oligo（dT）150.05μg/μl4μl（2μl）0.005μg/μl

（稀释10倍后用）

↓

混匀，离心，70℃5min

↓

立即冰水浴，稍离心

↓

试剂

浓度

体积

终浓度

M-MLVBuffer

5×

8μl（4μl）

1×

dNTP

10mM

2μl（1μl）

0.5mM

RNasin

40U/μl

1μl（0.5μl）

20μ

M-MLV

200U/μl

2μl（1μl）

200U

总体积40μl（20μl）

↓

混匀，离心，42℃60min

↓

95℃10min（破坏MLV）

↓

4℃保存

两步法RT-PCR

（第二步：

PCR反应）

总体积20μl（50μl）

试剂

浓度

体积

终浓度

TaqBuffer

10×

2μl（5μl_）

1×

MgCl2

25mM

1.2μl（3μl）

1.5mM

dNTP

10mM

0.2μl（0.5μl）

<200uM

上游引物

10pmol/μl

0.3μl（1μl）

10pmol

下游引物

10pmol/μl

0.3μl（1μl）

10pmol

cDNA模板

X（?

）（1-10μl）

DEPC水

20μl—4.3μl—X

Taq酶

2.5U/μl

0.3μl（1μl）

2.5U/μl

↓

混匀

↓

97℃，5分钟

↓

立即冰水浴

↓

混匀

↓

95℃

5分

预变性

94℃

30秒

变性

X℃

40秒

退火

72℃

30秒

延伸

72℃

7分

终末延伸

28-36循环，4℃保温

三、电泳：

加1-10μlPCR产物+溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。

注意：

Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。

dNTP勿反复冻融。

逆转录聚合酶联反应（reversetranscriptase，RT-PCR）

RT-PCR是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获取目的基因或检测基因表达的实验技术。

RT-PCR的基本原理是：

首先RNA在逆转录酶作用下反转录为cDNA第一链：

脱氧核苷酸引物与mRNA杂交，在RNA依赖的DNA聚合酶指导下合成互补的cDNA序列；然后在DNA聚合酶的作用下扩增目的基因：

PCR第一个循环由正义引物和cDNA第一链退火结合，在DNA依赖的DNA聚合酶指导下合成第二链，从PCR第二循环起开始扩增目的片段。

1.反转录酶的选择：

现在主要有三种反转录酶可供选择，莫勒尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLVRT）和禽成髓细胞瘤病毒反转录酶（AMVRT）、来源于Thermusthermophilus,Thermusflavus等嗜热真菌的热稳定性反转录酶、缺乏RnaseH酶的M-MuLV反转录酶突变体（如Clontech的PowerScriptase和LifeTechnology的SuperScriptase）。

反转录酶

反应温度

RnaseH酶活性

引物

M-MuLV

37℃

较弱

Oligo（dT）、GSP、随机六核苷酸

AMV

42℃

高

Oligo（dT）、GSP、随机六核苷酸

RnaseH-M-MuLV

可在50℃

无

Oligo（dT）、GSP、随机六核苷酸

Tth聚合酶

更高

GSP

随机引物

适用于长的或具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。

主要用于单一模板的RT-PCR反应。

OligodT

适用于具有PolyA尾巴的RNA。

（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。

）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异性引物

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

AMV和M-MuLV缺乏3’→5’核酸外切酶活性，在催化聚合过程中容易发生错误，并且其反应底物dNTP的Km值较高，要求反应体系有较高的dNTP浓度。

AMV具有较高RnaseH酶活性，趋向于抑制cDNA的长度。

相对于AMV，M-MuLV的RnaseH酶活性较弱，不过其反应温度37℃较AMV低，不利于具有高度二级结构的RNA模板的反转录。

热稳定的Tth聚合酶在Mn2＋的存在时有反转录酶的活性，并且可以在高温下反转录RNA，可以消除RNA模板中的二级结构。

由于其在反转录和PCR两个阶段都起作用，可以用于RT-PCR一步法，在同一反应管中进行，不过起催化的cDNA长度仅1－2kb，并且不能和Oligo（dT）及随机六核苷酸引物连用。

RnaseH-M-MuLV反转录酶由于无RnaseH酶活性，可以合成更长的cDNA,并且转录效率更高，且允许在更高的温度下（50℃）下合成cDNA，有利于消除RNA模板中的二级结构。

2.反转录引物的选择

反转录引物的选择主要由RT-PCR的目的决定的，cDNA第一链可以由Oligo（dT）、GSP和随机六核苷酸引物引发，不同的引物针对不同的RNA模板的特异性决定了合成cDNA的数量和多样性。

4.关于一步法和二步法RT-PCR（一步法没有做过，仅供参考）

一步法

早期由于热稳定的Tth聚合酶在反转录和PCR两个阶段都起作用，设计了One-stepRT-PCR，但由于Mn2+的存在，目的片段的长度受到限制，只能扩增1kb左右的片段。

现在的One-stepRT-PCRkit大多用的是逆转录酶+DNA聚合酶。

如：

eppendorf的cMASTERTMRTplusPCR或Sigma的SYBRGreenQuantitativeRT-PCR。

优点：

1.  操作步骤简单，方便；

2.  步骤少，污染的机会也少；

3.  逆转录和扩增在一个反应管中进行，比较省人、财、物。

缺点：

1.  扩增目的片段受限制，一般最多3-5kb；

2.  一次逆转录只能扩增一个目的基因；

3.  引物一般只能选择GSP；

4.  相对于二步法较贵。

二步法

PT-PCR二步法是将逆转录和PCR扩增分两个阶段来完成。

我一般是采取OligodT作为逆转录的引物合成cDNA第一链，再用GSP或随机引物来扩增单个或全部的mRNA。

二步法的优缺点和一步法正好相对。

操作（二步法，M-MuLV反转录酶）

1.  转移1pg~100ng的poly（A）+RNA或10pg~1ug的总RNA至离心管中中，用水调节体积到8ul，加入2ul（0.2ug）Oligo（dT），和0.5ulRNasin，小心混匀后65℃，5分钟使样品变性，室温10分钟后，高速离心收集；

2.  依次加入：

10.5ul

4ul5×第一链缓冲液

0.5ulRNasin

2uldNTP混合液

2ulDTT

1ulM-MuLV反转录酶

总体积20ul

3.混匀后，37℃1小时，95℃5分钟灭活反转录酶和使RNA-cDNA变性。

放到冰上冷却，短暂离心收集，可以直接要于PCR扩增的模板。

关于阴性对照的设置：

一般设立3个阴性对照：

对照1，不加RNA模板；对照2，不加反转录酶；对照3，不加引物。

反转录产物一般可以直接用于PCR扩增，有特殊要求的可以用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀来纯化。

（自己没有做过）。

3.  PCR扩增：

在薄壁PCR反应管依次加入：

5ul10×PCR缓冲液

1uldNTP混合液

2ul正义引物

2ul反义引物

2ul反转录产物

2UTaqDNA聚合酶

水

总体积50ul

PCR仪无热盖的，加入一滴矿物油（约50ul）

反应条件（35个循环）

循环数  变性  退火  延伸

1  94℃2分钟    

2-36  94℃30s  55℃45s  72℃60s

末循环  72℃5分钟后4℃保温

具体的退火温度根据引物的Tm值确定，也可以通过梯度PCR来确定最佳的退火温度。

延伸时间一般根据1000bp/分钟来估计。

4.产物检测一般取5ul或9ulPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml的溴化乙锭）电泳来分析结果，以DNAMarker来指示大小。

OligodT

要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA适用。

他主要适合长链甚至全长

mRNA的RT，这样对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染，RNA降解

和RNA断裂（如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是DNA带那么就要考虑RNA出

现断裂的情况）其RT通常有标准浓度，比较好掌握。

随机引物

适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）

，关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe，事实上很多情

况下我们是没有分析RNA的二级结构的。

（我用RNAstructure分析，但是一般分析

发现复杂二级结构不是想到换用随机引物，而是考虑做巢式PCR或者考虑做二步

PCR，因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来，但是如果

引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不

容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增）事实上引物退火后面不远处如何出现严

重连续二级结构是我们需要注意的，改用随机引物做RT倒是是比较好的选择，但

是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。

特异性引物

适合各种RNA的RT，适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。

但是引物设计

质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照

一个温度做不是最佳选择，这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。

所以通

常适用于引物设计和合成有保障，引物退火处之后没有复杂二级结构，目的模板

丰度高（注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高，与总RAN是两个概念）的情况

。

通常不推荐。

有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo

dT，这时可以先用特异性引物试一试，看看情况再说，做不出来也不要紧，这不

是RT的最佳选择，只是不用多花钱的妥协选择而已^_^。

关于特异性引物到底用那

一条的说法比较多，其实什么上游下游都是相对的，模板旋转一下上下游不就倒

置了。

所以选择的指针有二。

其一看哪个引物设计的更好，参数更高，参数差不

多也可以考虑选择比较长的引物。

其二看是否某个引物后面就是连续的复杂二级

结构，如果有就一定不能选择这条。

至于其合成的cDNA更为特异从而以后PCR更为

特异的说法虽然有一定的道理，但是纯属于理论性质的，不能作为选择他的原因

。

通常加入某个引物（模板其实没有这个序列）RT，然后用这个引物扩增还是可

以得到很多非特异扩增产物的，只是片断一般不超过400bp。

所以使用特异性引物

特异性更高的说法不能全信，尤其是扩增片断比较短的时候（小于400bp）

我做RT的选择基本就是如果有随机引物和OligodT就优先使用，如果没有就先

用特异性引物做。