RTPCR sop.docx

1、RTPCR sopRT-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头：1ml、200l、20l3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20l吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个

2、13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用

3、。2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g 硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml5TBE （贮存液）再将5TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6缓冲液，4保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔

4、化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml溴化乙锭2.5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g六、需购置的Rt-PCR材料：（生工. Tel. 2236106.）Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00dNTP: 1支oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1支 110 -20DEPC 5g 110.00Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life techn

5、ologies 4Marker: 10g 0.2g/ml 150.00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）七、引物合成1、内参照：GAPDH正义：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3反义：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3-actin正义：5CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3反义：5TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT32、par-4:正义：5GGGACCTCGGAACTCAAC3反义：5TGTATCTGCCTGGGACTG33、退火温度计算2（A+T）+4（G+C）正反义平均数，再上下波动度（4，或5）4、引物各合

6、成5 OD，每OD一瓶分装好5、引物稀释：加DEPC水量为（l）= ? nmol / OD 管上所标OD数100是为10p mol / l 浓度的引物溶液八、PCR产物电泳先将1-10l左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前，打开离心机预冷。TRIzol法抽提总RNA细胞1107组织100mg加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织

7、匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）颠倒混匀10下，室温5分钟4，离心12000g，15分钟转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟4，离心12000g，10分钟弃上清加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4离心7500g，5分钟弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20l（10l-20l）（可在55-60水中，10分钟助溶）注：1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在

8、-60放置至少一个月（甚至可一年以上）3、RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年两步法RT-PCR（第一步：逆转录反应）试剂 浓度 体积 终浓度RNA 23l(11.5l)Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l （稀释10倍后用）混匀，离心，70 5min立即冰水浴，稍离心试剂浓度体积终浓度M-MLV Buffer58l (4l)1dNTP10mM2l (1l)0.5mMRNasin40U/l1l (0.5l)20M-MLV200U/l2l (1l)200U总体积40l（20l）混匀，离心，42 60min95 10min（破坏MLV）

9、4保存两步法RT-PCR（第二步：PCR反应）总体积20l(50l)试剂浓度体积终浓度Taq Buffer102l (5l_)1MgCl225mM1.2l (3l)1.5mMdNTP10mM0.2l (0.5l)200uM上游引物10pmol/l0.3l (1l)10pmol下游引物10pmol/l0.3l (1l)10pmolcDNA模板X (?) (1-10l)DEPC水20l4.3lXTaq酶2.5U/l0.3l (1l)2.5U/l混匀97，5分钟立即冰水浴混匀955分预变性9430秒变性X40秒退火7230秒延伸727分终末延伸28-36循环，4保温三、电泳：加1-10l PCR产物

10、+溴芬兰（1-2.5l）混匀，加样，电泳。注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20保存，操作时置于冰上。dNTP勿反复冻融。逆转录聚合酶联反应（reverse transcriptase，RT-PCR）RT-PCR是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获取目的基因或检测基因表达的实验技术。RT-PCR的基本原理是：首先RNA在逆转录酶作用下反转录为cDNA第一链：脱氧核苷酸引物与mRNA杂交，在RNA依赖的DNA聚合酶指导下合成互补的cDNA序列；然后在DNA聚合酶的作用下扩增目的基因：PCR第一个循环由正义引物和cDNA第一链退火结合，在D

11、NA依赖的DNA聚合酶指导下合成第二链，从PCR第二循环起开始扩增目的片段。1.反转录酶的选择：现在主要有三种反转录酶可供选择，莫勒尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）和禽成髓细胞瘤病毒反转录酶（AMV RT）、来源于Thermus thermophilus,Thermus flavus等嗜热真菌的热稳定性反转录酶、缺乏Rnase H酶的M-MuLV反转录酶突变体（如Clontech的PowerScriptase和Life Technology的SuperScriptase）。反转录酶反应温度Rnase H酶活性引物M-MuLV37较弱Oligo(dT)、GSP、随机六核苷酸AMV42

12、高Oligo(dT)、GSP、随机六核苷酸Rnase H- M-MuLV可在50无Oligo(dT)、GSP、随机六核苷酸Tth聚合酶更高GSP随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。Oligo dT适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目

13、的序列已知的情况。AMV和M-MuLV缺乏35核酸外切酶活性，在催化聚合过程中容易发生错误，并且其反应底物dNTP的Km值较高，要求反应体系有较高的dNTP浓度。AMV具有较高Rnase H酶活性，趋向于抑制cDNA的长度。相对于AMV，M-MuLV的Rnase H酶活性较弱，不过其反应温度37较AMV低，不利于具有高度二级结构的RNA模板的反转录。热稳定的Tth聚合酶在Mn2的存在时有反转录酶的活性，并且可以在高温下反转录RNA，可以消除RNA模板中的二级结构。由于其在反转录和PCR两个阶段都起作用，可以用于RT-PCR一步法，在同一反应管中进行，不过起催化的cDNA长度仅12kb，并且不能

14、和Oligo(dT)及随机六核苷酸引物连用。Rnase H- M-MuLV反转录酶由于无Rnase H酶活性，可以合成更长的cDNA,并且转录效率更高，且允许在更高的温度下（50）下合成cDNA，有利于消除RNA模板中的二级结构。2.反转录引物的选择反转录引物的选择主要由RT-PCR的目的决定的，cDNA第一链可以由Oligo(dT)、GSP和随机六核苷酸引物引发，不同的引物针对不同的RNA模板的特异性决定了合成cDNA 的数量和多样性。4.关于一步法和二步法RT-PCR（一步法没有做过，仅供参考）一步法早期由于热稳定的Tth聚合酶在反转录和PCR两个阶段都起作用，设计了One-step RT

15、-PCR，但由于Mn2+的存在，目的片段的长度受到限制，只能扩增1kb左右的片段。现在的One-step RT-PCR kit大多用的是逆转录酶+DNA聚合酶。如：eppendorf的cMASTERTM RT plus PCR或Sigma的SYBR Green Quantitative RT-PCR。优点：1.操作步骤简单，方便；2.步骤少，污染的机会也少；3.逆转录和扩增在一个反应管中进行，比较省人、财、物。缺点：1.扩增目的片段受限制，一般最多3-5kb；2.一次逆转录只能扩增一个目的基因；3.引物一般只能选择GSP；4.相对于二步法较贵。二步法PT-PCR二步法是将逆转录和PCR扩增分两

16、个阶段来完成。我一般是采取Oligo dT作为逆转录的引物合成cDNA第一链，再用GSP或随机引物来扩增单个或全部的mRNA。二步法的优缺点和一步法正好相对。操作（二步法，M-MuLV反转录酶）1.转移1pg100ng的poly（A）+RNA或10pg1ug的总RNA至离心管中中，用水调节体积到8ul，加入2ul（0.2ug） Oligo(dT)，和0.5ul RNasin，小心混匀后65，5分钟使样品变性，室温10分钟后，高速离心收集；2.依次加入：10.5ul 4 ul 5第一链缓冲液0.5 ul RNasin2 ul dNTP 混合液2 ul DTT1 ul M-MuLV反转录酶总体积

17、20 ul3.混匀后，371小时，955分钟灭活反转录酶和使RNA-cDNA变性。放到冰上冷却，短暂离心收集，可以直接要于PCR扩增的模板。关于阴性对照的设置： 一般设立3个阴性对照：对照1，不加RNA模板；对照2，不加反转录酶；对照3，不加引物。反转录产物一般可以直接用于PCR扩增，有特殊要求的可以用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀来纯化。（自己没有做过）。3.PCR扩增：在薄壁PCR反应管依次加入：5ul 10PCR缓冲液1ul dNTP 混合液2ul 正义引物2ul 反义引物2ul 反转录产物2U Taq DNA聚合酶水总体积 50ulPCR仪无热盖的，加入一滴矿物油（约50ul）反应条件（35个

18、循环）循环数变性退火延伸1942分钟2-369430s5545s7260s末循环725分钟后4保温具体的退火温度根据引物的Tm值确定，也可以通过梯度PCR来确定最佳的退火温度。延伸时间一般根据1000bp/分钟来估计。4.产物检测 一般取5ul或9ulPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml的溴化乙锭）电泳来分析结果，以DNA Marker来指示大小。Oligo dT 要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA适用。他主要适合长链甚至全长mRNA的RT，这样对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染，RNA降解和RNA断裂（如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是

19、DNA带那么就要考虑RNA出现断裂的情况）其RT通常有标准浓度，比较好掌握。随机引物适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低），关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe，事实上很多情况下我们是没有分析RNA的二级结构的。（我用RNAstructure分析，但是一般分析发现复杂二级结构不是想到换用随机引物，而是考虑做巢式PCR或者考虑做二步PCR，因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来，但是如果引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增）事实上引物退火后面不

20、远处如何出现严重连续二级结构是我们需要注意的，改用随机引物做RT倒是是比较好的选择，但是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。特异性引物 适合各种RNA的RT，适合序列肯定的模板，常用于一步法RTPCR。但是引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。所以通常适用于引物设计和合成有保障，引物退火处之后没有复杂二级结构，目的模板丰度高（注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高，与总RAN是两个概念）的情况。通常不推荐。有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo

21、dT，这时可以先用特异性引物试一试，看看情况再说，做不出来也不要紧，这不是RT的最佳选择，只是不用多花钱的妥协选择而已_。关于特异性引物到底用那一条的说法比较多，其实什么上游下游都是相对的，模板旋转一下上下游不就倒置了。所以选择的指针有二。其一看哪个引物设计的更好，参数更高，参数差不多也可以考虑选择比较长的引物。其二看是否某个引物后面就是连续的复杂二级结构，如果有就一定不能选择这条。至于其合成的cDNA更为特异从而以后PCR更为特异的说法虽然有一定的道理，但是纯属于理论性质的，不能作为选择他的原因。通常加入某个引物（模板其实没有这个序列）RT，然后用这个引物扩增还是可以得到很多非特异扩增产物的，只是片断一般不超过400bp。所以使用特异性引物特异性更高的说法不能全信，尤其是扩增片断比较短的时候（小于400bp）我做RT的选择基本就是 如果有随机引物和Oligo dT就优先使用，如果没有就先用特异性引物做。