泛素蛋白酶体通路与药物研发.docx

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泛素蛋白酶体通路与药物研发

泛素-蛋白酶体通路与药物研发

泛素-蛋白酶体通路是细胞内一种具有特异性、耗能、高效的蛋白质降解过程，是基因和蛋白质功能的主要调节者和终结者。

泛素-蛋白酶体通路的基础性研究成果阐释了生命活动的基本规律,其相关的病理学研究为新药研究开发提供了潜在的重要的药物靶标。

本文旨在从泛素-蛋白酶体通路基本概念、该通路异常与疾病发生、药物研发3个方面进行阐述。

1泛素-蛋白酶体通路

泛素-蛋白酶体通路掌控着机体生长、发育、生殖、衰老等重大生命过程，调控细胞周期、细胞分化、凋亡、DNA复制和修复、转录以及蛋白质质量监控等细胞活动，并参与病原体的入侵、致病和免疫应答等过程。

该通路由底物蛋白质泛素化和底物通过蛋白酶体降解2个过程组成。

泛素是一条由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链。

泛素通常以2种形式存在，其一是游离形式，另一种形式是与受体蛋白共价结合。

泛素通过其C端与受体蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基或受体蛋白N端的α-氨基共价结合的过程称为泛素化。

泛素化是一个主要由泛素激活酶E1（ubiquitin-activatingenzyme），泛素聚合酶（亦称泛素载体蛋白）（ubiquitin-carrierprotein）E2和泛素连接酶E3（ubiquitin-proteinligase）等介导的多酶级联反应。

泛素激活酶E1在进化中很保守，是一种ATP依赖的酶，通过与泛素的C端形成高能硫酯键而激活泛素。

与E1不同，细胞内存在多种E2。

E2与活化的泛素结合形成E2-泛素复合体，E2协助特异性E3将活化的泛素转移到底物。

泛素连接酶E3是泛素化反应系统中数量最大、结构最多样、调控机制最为复杂的成员，它可以直接与底物或通过辅助蛋白与底物相互作用，从而决定泛素介导底物蛋白质降解的选择性（见图1）。

哺乳动物细胞内的E3主要有三大类，即含HECT（homologoustoE6-APC-terminal）结构域的E3、含环指结构（RINGfinger）的E3、含U-box的E3。

E3在泛素化过程中的作用主要包括3个阶段：

E3与E2的相互识别与作用、E3与底物蛋白质的相互识别与作用、E3催化泛素与底物蛋白质的连接及泛素与泛素之间的连接。

最终，泛素通过其C端与受体蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基发生共价结合，而这些泛素分子上的48位、63位赖氨酸又可以作为修饰位点，如此，底物蛋白上可以形成多泛素链。

一般地，由48位赖氨酸残基连接的4个或更多个泛素的底物蛋白质可以被26S蛋白酶体识别并将其降解，而由63位赖氨酸残基连接的泛素链则不参与蛋白质的降解过程，其主要与细胞内信号转导过程和DNA修复等相关。

泛素在泛素化修饰的底物蛋白质被26S蛋白酶体降解之前，可以被去泛素化酶（deubiquitinatingenzyme，DUB）水解脱离下来，从而避免其与底物蛋白一道被降解，解离下来的游离形式的泛素可以被循环使用。

蛋白酶体是一种巨大的具有四级结构的复合蛋白酶（约2000kD），具有多种蛋白水解酶的活性，其蛋白降解功能主要依赖于泛素化过程。

26S蛋白酶体由20S核心复合物（coreparticle，CP）和19S调节复合物（regulatoryparticle，RP，也称PA700）组成。

其中，20S是由4个同轴的、7个亚基组成的七聚体环叠而成的中空桶装结构。

两侧外环由αl-α7亚单位组成，2个内环由β1-β7亚单位组成。

3个组成型表达的β亚基（β1、β2、β5）具有苏氨酸蛋白酶活性位点（分别为“半胱天冬酶-样”活性位点、“胰蛋白酶-样”活性位点、“胰凝乳蛋白酶-样”活性位点），且被封闭在降解腔的内侧，从而有效阻止正常折叠的蛋白质进入降解腔。

19S调节复合物可以识别泛素化底物，去折叠底物并释放游离形式的泛素，打开α环上的降解通道并将去折叠的底物送入降解腔。

所以，泛素-蛋白酶体介导的迅速且不可逆的特异性蛋白质降解是一个高度复杂、受到严格调控的生命过程。

图1泛素-蛋白酶体通路

Fig.1Ubiquitin-proteasomepathway

Ub：

泛素；E1：

泛素激活酶；E2：

泛素载体蛋白；E3：

泛素连接酶；DUB：

去泛素化酶

2泛素-蛋白酶体通路的异常与人类重大疾病的发生

泛素-蛋白酶体通路通过降解特定功能的蛋白质来调控细胞的基本生命活动，通过降解异常或受损伤的蛋白质以维持细胞的正常活动。

故此，该通路功能紊乱与多种疾病相关，如果这一系统的功能过分活跃，可能会摧毁维持细胞正常生命活动所需的蛋白，反之，如果该系统无法有效工作会导致异常蛋白在细胞内积累。

泛素-蛋白酶体系统紊乱导致细胞内蛋白质的动态平衡状态被打破，蛋白质代谢失衡引发疾病，包括神经退行性疾病（如阿尔茨海默症和帕金森病）、癌症、炎症、心血管和呼吸系统疾病、糖尿病、白血病、动脉粥样硬化、病毒感染、肝脏疾病等，以下以神经退行性疾病和癌症为例作简要说明。

2.1泛素-蛋白酶体通路与神经退行性疾病神经退行性疾病是一种大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态[6]。

在患有帕金森病（PD）、阿尔茨海默症（AD）、亨廷顿病（Huntington）、肌萎缩性侧索硬化（ALS）或多谷氨酰胺病（PolyQ）的患者中发现，中枢神经系统的细胞内外聚集着大量突变或损伤的蛋白[7]。

突变和遗传性因素能够引发错误折叠的蛋白质的堆积，引起泛素-蛋白酶体系统功能障碍，导致底物蛋白质异常堆积、神经元细胞功能衰竭甚至细胞死亡[8]。

阿尔茨海默症表现为认知障碍和记忆力衰退，其标志性的病理特征是形成老年斑和神经细胞内神经原纤维形成缠结，其发病机制是细胞内过度磷酸化Tau蛋白和β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的聚集。

Aβ的聚集沉积会导致大量自由基的产生，从而抑制蛋白酶体的活性，导致细胞无法降解堆积的Aβ聚集体，形成恶性循环[9]。

Tau是微管相关蛋白，对维持微管稳定性发挥重要作用。

而过度磷酸化的Tau丧失正常生理功能，微管结构被破坏引发神经突触障碍和功能损伤，且抑制蛋白酶体的活性。

此外，突变形式的泛素UBB+1大量聚集于老年斑块和神经纤维缠结中。

UBB+1形成的多泛素链对酶切割的耐受性远远高于正常泛素链，因而UBB+1修饰的底物蛋白不易被蛋白酶体降解，且破坏蛋白酶体的功能[10]。

泛素-蛋白酶体系统功能下降、Aβ与Tau蛋白异常并最终导致蛋白酶体功能受到抑制是阿尔茨海默症的主要病因。

帕金森病的主要临床特点是静止性震颤、动作迟缓和减少、肌张力增高、姿势不稳等，其病理特征为黑质多巴胺能神经元变性缺失、残存的神经元胞浆内出现特征性的嗜酸性包涵体Lewy小体[11-12]。

α-synuclein突触核蛋白、Parkin（泛素连接酶E3）和UCH-L1（去泛素化酶）的基因突变常与帕金森病的病理变化相关，且与泛素-蛋白酶体系统功能障碍密切相关[13]。

如Parkin基因突变可导致常染色体隐性遗传性帕金森病-青年型或早发型帕金森病，Parkin突变使其底物不能被有效泛素化修饰，进而导致蛋白酶体不能及时清除异常蛋白[如Parkin相关内皮受体样受体（Parkin-associatedendothelinreceptorlikereceptor,PaelR）]，蛋白聚集致使多巴胺能神经元死亡。

2.2泛素-蛋白酶体通路与肿瘤肿瘤主要表现为细胞的过度增殖。

除细胞增殖和分化异常外，肿瘤细胞抗凋亡能力的增强也是疾病发生和发展的关键环节。

很多与肿瘤发生相关的调控蛋白都是蛋白酶体的底物，泛素-蛋白酶体通路通过调控细胞周期相关蛋白、NF-κB转录因子、p53等肿瘤抑制因子的蛋白水平影响肿瘤细胞的存活。

阻断致癌蛋白降解或者促进抑癌蛋白的降解都可能会扰乱细胞周期、细胞生存或细胞死亡信号通路，导致肿瘤发生[14]。

泛素-蛋白酶体通路对细胞周期的调节具有精确的时间性和空间性。

细胞周期因子的泛素化是其被特异性降解的基础。

p27，细胞周期蛋白（cyclin）D1及E都是泛素-蛋白酶体的底物。

肿瘤组织中，p27蛋白水平下调与蛋白酶体活性上调相关。

相反，细胞周期蛋白B、D1及E蛋白水平上调，如细胞周期蛋白D降解缺陷，导致其持续高水平表达是乳腺癌的主要原因。

NF-κB转录因子与肿瘤发生、发展以及放化疗抵抗密切相关。

正常生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB以无活性的复合物形式存在于细胞质中；当细胞受到DNA损伤等信号刺激时，IκB被IκB激酶复合体磷酸化，继而被SCF β-TRCP泛素化修饰，最终被蛋白酶体降解[15]。

游离的活化形式的NF-κB转位至细胞核，调控免疫炎症反应相关基因、病毒相关基因以及原癌基因等的转录[16]。

NF-κB信号通路的激活与癌症的发生发展、血管新生、癌转移过程密切相关。

某些肿瘤可表现出持久的、组成性的NF-κB信号通路激活状态。

泛素蛋白酶体通路对NF-κB信号通路的调节主要包括3个方面：

降解IκB、激活IκB激酶复合体、加工处理NF-κB前体。

例如在圆柱瘤（Cylindroma）等癌症中，作为一种肿瘤抑制蛋白，IκB去泛素化酶CYLD发生突变，从而削弱了其底物IκB的去泛素化作用，促进泛素化修饰的IκB被蛋白酶体降解、最终导致NF-κB信号通路活化[17]。

p53的抑癌机制主要在于其能够在DNA损伤时阻滞细胞周期进程并激活DNA修复蛋白，若DNA损伤不被修复，则诱导细胞凋亡。

但在非小细胞肺癌等肿瘤细胞中，p53的泛素连接酶MDM2过表达，而去泛素化酶HAUSP则下调，如此增强对p53蛋白水平的负调节，帮助肿瘤细胞逃逸凋亡[18-19]。

3药物研发

泛素-蛋白酶体通路是疾病治疗的潜在靶点（见表1）。

针对该通路设计药物，首先应当明确疾病的类型以及药物的作用机制，研究发现，抑制过度活跃的或是过表达的组分比作用于突变蛋白并使其恢复活性更容易；其次，需要明确泛素-蛋白酶体通路中可作为药物靶点的组分的特定类别，包括泛素活化酶、去泛素化酶、接头蛋白等。

此外，很多编码泛素-蛋白酶体通路组分的基因属于多基因家族，具有多态性，应注意药物作用的特异性。

表1作用于泛素-蛋白酶体通路的药物或化合物

Tab.1Drugsrelatedtotheubiquitin-proteasomepathway

3.1蛋白酶体抑制剂蛋白酶体活性增加与多种恶性疾病相关。

肿瘤细胞中通常聚集着较高丰度的异常蛋白且对蛋白酶体的活性依赖更大，使其对蛋白酶体抑制作用更为敏感。

蛋白酶体抑制剂改变了促凋亡蛋白与抑凋亡蛋白之间的平衡，抑癌蛋白积累，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。

另外，抑制蛋白酶体活性是化疗增敏和克服肿瘤耐药性的有效策略。

硼替佐米（Bortezomib）是第一例被美国FDA批准上市的以泛素-蛋白酶体通路为靶点的蛋白酶体抑制剂类药物。

它能够特异性地与20S蛋白酶体的β5亚基的苏氨酸羟基的活性部位结合，有效抑制类胰凝乳蛋白酶活性。

硼替佐米是美国近年来第一个被批准用于治疗多发性骨髓瘤的高效药物，可有效延缓肿瘤进展、改善患者生存状况，已成为复发性多发性骨髓瘤的标准治疗药物。

但硼替佐米用于治疗癌症仍存在2个主要的问题：

①蛋白酶体抑制相关联的细胞毒性作用和药物脱靶效应，可能是因为蛋白酶体主要在细胞内大部分信号通路的下游交叉点发挥作用；②内在的和获得性的耐药性，可能是因为体内蛋白质的调节失衡，从而引起机体的一系列补偿代谢，激活胞外其他降解蛋白质的途径，主要反映为单一用药效果不佳，如对于半数的多发性骨髓瘤患者而言，硼替佐米单一疗法的治疗效果并不理想[45-47]。

为突破硼替佐米的局限性，现已研发Carfizomib和Oprozomib等第二代蛋白酶体抑制剂，它们具有独特的化学结构、生化特性、结合亲和性、选择性，更利于提高抗癌效果并降低不良反应。

如Carfizomib与其它β亚基（β1、β2）结合能力弱于硼替佐米[21,48-49]。

当输出电压vo不变，电容取值增大则相应的电流也会增加，为确保负载性能，电感电流也随之增加，虚拟电容的存在在控制上相当于在电流内环加入了一个电容反馈装置，改变相应的电流期望值则等效于虚拟电容的影响。

阻断p53的泛素连接酶MDM2和p53之间的相互作用或者使MDM2失活，可以恢复p53的活性，以促进癌细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡。

第一个以MDM2为靶点的小分子抑制剂是Nutlin[50]。

在结构上，Nutlin可模拟p53蛋白中与MDM2结合的关键位点的空间构象，进而取代p53，占据MDM2蛋白中的p53结合位点，避免p53被泛素化修饰而降解。

RITA是另外一种稳定p53的小分子药物，它通过与p53的N端结合而有效阻止了p53与MDM2之间相互作用[31]。

3.3去泛素化酶抑制剂去泛素化酶家族多属于半胱氨酸蛋白酶，与19S蛋白酶体相关的去泛素化酶主要有UCHL5（orUCH37）、USP7、USP14和POU1（Rpn11）[51]。

P5091与P22077主要作用于USP7，P5091属于噻吩类小分子抑制剂，由美国Progenra公司研发。

研究表明对硼替佐米治疗产生耐药性的多发性骨髓瘤使用P5091后可以诱导肿瘤细胞的凋亡，且临床上P5091多与地塞米松或来那度胺联用以增强抑瘤效果[34]。

小分子药物bAP-15可以作用于USP14和UCH-L5，致使多泛素化修饰的蛋白累积，非基因毒性细胞周期阻滞（G2/M期），有效抑制结肠癌等实体瘤的发展[52]。

虽然bAP-15的作用靶点是蛋白酶体，但其药效却有别于硼替佐米，bAP-15可以诱导p53突变的、Bcl2过表达的肿瘤细胞发生细胞凋亡，从而治疗耐硼替佐米药性的肿瘤[52]。

3.4其它相关抑制剂泛素蛋白酶体系统的其他组分，如E1，亦可以作为药物靶点。

针对E1研发的抑制剂主要有2类：

一是泛素或类泛素蛋白腺苷酰化抑制剂，阻止泛素或类泛素蛋白接近E1的腺苷酰化修饰位点或封闭ATP结合位点，如imatinib是一种以ATP结合位点为靶点的蛋白激酶类抑制剂[53]；二是阻断E1和E2之间的相互作用。

E1类抑制剂最大的局限性在于，保守的E1是泛素活化活动的起点，E1被抑制会引发多种信号通路瘫痪，从而可能对细胞正常活动产生影响。

此外，还有免疫蛋白酶体特殊亚基（β1i、β2i、β5i）类抑制剂，主要通过可逆或不可逆的结合β1i、β2i、β5i亚基，以空间位阻降解蛋白质结合位点，进而阻断蛋白质降解过程，使细胞周期停滞，如IPSI-001等，可以有效抑制复发性骨髓瘤。

4展望

泛素-蛋白酶体通路异常与疾病的发生和发展紧密相关。

以泛素-蛋白酶体通路为靶点的药物，如蛋白酶体抑制剂、泛素连接酶抑制剂、去泛素化酶抑制剂等，在神经退行性疾病和癌症等疾病的治疗中具有广阔的前景。

但现阶段的药物仍有一定的局限性，如单一治疗耐药性、特异性较差、脱靶效应引起的副作用等，因此寻找新的靶标，合理设计联合治疗策略等将是解决以上问题的主要着眼点。

随着该通路基础研究的进展和对疾病发生机制的深入了解，人们对泛素介导的蛋白质降解调控机制以及蛋白质相互作用的信息会有更加深刻的认识，针对某一特定的生物学过程设计小分子药物可能是未来药物研发与设计的主要方向。