慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用.docx

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慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用

慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用

（作者:

___________单位:

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___________）

作者：

马燕花，杨少军，赵建雄【摘要】目的观察中药慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的防治作用。

方法建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，随机分为正常组、模型组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低剂量组、东宝肝泰阳性药物对照组，观察肝组织病理形态学的变化，检测肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的含量。

免疫组化技术检测环氧合酶2（COX2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在肝脏的表达。

结果模型组大鼠肝组织出现脂肪变性及不同程度的炎性细胞浸润，镜下可见肝细胞内大量脂滴。

与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内SOD活性显著降低，MDA、NO含量显著提高，COX2、iNOS蛋白表达显著提高，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内SOD活性显著提高，MDA、NO含量显著降低，COX2、iNOS蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义；中药慈菇消脂丸高剂量组作用亦较阳性药物对照组显著。

结论慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎具有明显的防治作用，其作用机制与改善肝组织脂肪变性程度、抑制脂质过氧化、抗炎有关。

【关键词】非酒精性脂肪性肝炎；慈菇消脂丸；环氧合酶2；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮　　ABSTRACT:

ObjectiveToobservethepreventiveandtherapeuticeffectsofSagittaraSagittifoliaL.XiaoZhiPillsonnonalcoholicsteatohepatitis（NASH）inrats.MethodsRatNASHmodelswereestablishedandtheratsweredividedrandomlyintofivegroups:

thenormalgroup,modelgroup,highdosagegroupandlowdosagegroupsofthetreatment,andDongbaoGantaipositivedruggroup.Histopathologicalchangesoftheliverwereobserved.ThelevelsofMDA,superoxidedismutase（SOD）,andNO（nitricoxide）intheliverhomogenateweredetermined.Expressionsofcyclooxygenase2（cox2）andinduciblenitricoxidesynthase（iNOS）intheliverweredeterminedwithimmunohistochemicaltechnique.ResultsInmodelgroup,extensiveadiposedegenerationandinflammatorycellinfiltrationwerefoundintheliver.Comparedwiththoseinnormalgroup,SODactivitiesinmodelgroupwereobviouslydecreased（P0.01）,thecontentsofMDAandNOwereobviouslyincreased（P0.01）,andtheexpressionsofcox2andiNOSproteinswereobviouslyincreased（P0.01）.Comparedwiththoseinmodelgroup,theactivitiesofSODintreatmentgroupswereobviouslyincreased（P0.01）,thecontentsofMDAandNOwereobviouslydecreased（P0.01）,andtheexpressionsofCOX2andiNOSproteinswereobviouslydecreased（P0.01）.TheeffectofhighdosagegroupwasmoreobviousthanthatofDongbaoGantaigroup（P0.05）.ConclusionSagittaraSagittifoliaL.XiaoZhiPillscaneffectivelypreventandtreatnonalcoholicsteatohepatitisinrats,anditsmechanismmaybeassociatedwithamelioratinghepatocellularsteatosis,removingthefreeradicalsandenhancingtheantioxidationandantiinflammationcapability.　　KEYWORDS:

nonalcoholicsteatohepatitis;SagittaraSagittifoliaL.XiaoZhiPills;cyclooxygenase2;induciblenitricoxidesynthase;nitricoxide　　1980年，LUDWID等[1]首先提出了非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis,NASH）的概念，是以无过量饮酒史以及肝细胞脂肪变性、气球样变、弥漫性肝小叶炎症和（或）肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积为特征的慢性肝脏疾病。

发病机制至今尚未明确，DAY和JAMES等[2]根据动物实验的结果提出两次打击学说。

目前缺乏有效的防治手段。

脂肪肝属祖国医学“肥气”、“癥瘕”、“积聚”范畴，肝郁、痰湿、瘀血、浊毒为其主要发病机制。

本文拟通过动物实验探讨中药慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎的防治作用及其可能的机制。

　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物　　雄性SD大鼠，SPF级，体重200～240g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：

SCXK2004006。

　　1.1.2实验药物　　慈菇消脂丸由山慈菇、泽泻、柴胡、生山楂、决明子、甘草等10味药物组成，甘肃中医学院附属医院制剂中心提供，生产批号：

071217。

东宝肝泰片，由通化东宝药业股份有限公司提供，批号：

070508。

普通饲料和高脂饲料由北京可澳协力饲料有限公司提供。

　　1.1.3主要的试剂和仪器　　超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、微量丙二醛（MDA）测定试剂盒、NO试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

Sp9001兔SP免疫组化试剂盒由北京金桥中杉公司提供。

RabbitantiCOX2一抗、RabbitantiiNOS一抗、DAB（显色剂）购自武汉博士德生物工程有限公司。

DZW4型恒温水浴箱，金坛市恒丰仪器厂。

BP211D型电子天平，Sartorius公司。

PLCO型台式高速离心机，德国Heraeus公司。

UNICOUV2102C型紫外分光光度仪，日本岛津公司。

　　1.1.4高脂饲料配方　　普通饲料82.5%，10%猪油，2%胆固醇，0.5%胆酸钠，5%蛋黄粉。

　　1.2方法　　1.2.1大鼠脂肪肝模型的建立[3]与给药方法　　50只SD雄性大鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低剂量组、阳性药物对照组。

正常组普通饲料喂养，其余4组均采用高脂饲料喂养，同时按大鼠体重2mL/kg400g/L四氯化碳豆油溶液，皮下注射，每周2次。

造模4周后，四氯化碳模型组分为高剂量给药组，给药剂量为1.6g/kg，给药体积10mL/kg大鼠；低剂量给药组，给药剂量为0.80g/kg；阳性给药组，给药剂量为0.32g/kg；模型对照组给予同体积生理盐水。

连续给药30d后解剖所有大鼠，取出肝脏，称重，迅速从肝左叶中部切取一小块肝组织，按常规制备石蜡切片保存备用。

　　1.2.2检测体重、肝脏指数　　麻醉动物后称量体重、肝重，并计算肝脏指数（肝湿重/体重×100%）　　1.2.3生化指标测定　　取肝右叶约0.5g，4℃下制成100g/L（10%）肝匀浆，分别测定SOD、MDA、NO。

按照试剂盒说明书操作。

　　1.2.4肝脏组织HE染色　　取肝左叶组织，100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色后在显微镜下观察肝组织的病理学变化。

　　1.2.5免疫组化染色检测COX2、iNOS表达　　采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组化法（SP）。

肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，用高温进行抗原修复，30mL/L过氧化氢灭活内源性酶后，50g/LBSA封闭20min，滴加不同浓度特异性一抗后4℃过夜，次日滴加偶联二抗，室温30min后DAB显色，苏木精复染，透明，封片。

每次实验均设阴性对照，以PBS缓冲液代替一抗，结果显示阴性。

　　1.3统计学处理　　采用统计软件SPSS11.0进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，显著性检验采用单因素方差分析，检验水准为0.05，差异有统计学意义。

　　2结果　　2.1各组大鼠肝脏指数、肝组织SOD活力、MDA、NO含量的比较　　模型组肝脏指数较正常对照组显著增加（P0.01）；与模型组相比较，中药高剂量组及阳性药物对照组肝脏指数均明显下降（P0.05）；而中药低剂量组肝脏指数则无明显改变（P0.05）；中药治疗组与阳性药物组之间亦无明显差异（P0.05）。

与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内SOD活性显著降低（P0.01），MDA、NO含量显著提高（P0.01），差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内SOD活性显著提高（高剂量组P0.01，低剂量组P0.05），MDA、NO含量显著降低（高剂量组P0.01，低剂量组P0.05），差异具有统计学意义；除NO外，其他指标中药慈菇消脂丸高剂量组作用均较阳性药物对照组显著（P0.05，表1）。

表1慈菇消脂丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏指数、肝组织SOD、MDA、NO含量的影响（略）　　2.2肝组织病理学的变化　　给药30d后解剖，肉眼观察正常对照组大鼠肝脏为红色，边缘锐利，表面光滑，模型组肝脏明显肿大，呈黄色缺血状。

给药各组肝肿大有所缓解，颜色变红。

HE染色镜下观察，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞呈多边形围绕中央静脉呈放射状，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。

CCl4模型组肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫性脂肪变性，脂滴大小不等，部分融合为大脂滴，界限不清。

肝索紊乱，少数可见点状坏死，碎霄样坏死和炎性细胞浸润。

中药高剂量组肝小叶结构完整，脂肪变性细胞数目明显减少，反见一些细小脂滴散布于细胞内，肝索排列整齐。

中药低剂量组肝小叶结构尚清晰，脂肪变性细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少或消失，反见一些细小脂滴散布于细胞内，偶见个别大脂滴，肝索排列整齐。

阳性药物对照组表现同中药高剂量组（图1）。

　　2.3肝组织COX2、iNOS的表达　　阳性细胞为胞浆或核膜呈棕黄色或棕褐色颗粒。

COX2、iNOS主要表达于血管内皮细胞及肝小叶中央静脉周围的肝细胞、枯否细胞内。

在200倍镜下，用高清晰度彩色图像病理图文分析系统测量其吸光度值。

每张切片随机选取5个视野，计算平