白血病小鼠模型的建立及鉴定.docx

白血病小鼠模型的建立及鉴定.docx

《白血病小鼠模型的建立及鉴定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白血病小鼠模型的建立及鉴定.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

白血病小鼠模型的建立及鉴定

白血病小鼠模型的建立及鉴定

pMSCV-BC/ABLI-lRES-GFP逆转录病毒上清感染6〜10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞，移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠，建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型；监测移植小鼠的体质量，生存率；流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFF表达（代表有核细胞表达BCR/ABL1）和细胞分型;观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化.结果：

移植20d后，移植小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态，体质量明显降低；流式细胞仪检测外周血中出现GFF+细胞，并且随着移植时间的延长，GFP粒细胞明显增多.移植小鼠的生存率较对照组明显降低.移植小鼠发病后表现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色表现大量细胞浸润，且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1鈿胞，即BCR-ABL1+粒细胞白血病细胞.结论：

利用此方法成功建立了BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，

为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台.

【关键词】BCR-ABL1+粒细胞白血病;BCR-ABL1;小鼠；生存率;逆转录病毒载体

0引言

细胞失去分化水平，过度增殖为特征的骨髓增生性疾病，是一种伴有t（9;22）（q34;q11）染色体易位的恶性增生性疾病［1］．该易位染色体由位于9号染色体的原癌基因ABL1部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCR区（breakpointclusterregion,BCR）形成］2］,其

编码的蛋白具有高度异常酪氨酸激酶活性，造成了CML细胞对酪氨酸

激酶抑制剂的抵抗］3］.所以，研究CML的发病机制和治疗药物显得尤为重要，而一个良好的实验平台是研究机制和药理的基础．研究［4—5］发现，虽然我们能够利用将CML患者的白血病细胞移植给NOD/SCIDJ、鼠构建的小鼠模型来研究白血病细胞是否导致并维持了CML但是这种模型不能造成致死性CML且耗时较长；而BCR-ABL转基因小鼠模型因为不能完全发展成为髓系增生性疾病且具有潜伏期长的局限性，不利于治疗药物的研究［4—5］.逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型则是一种稳定高效的诱导方式［6］,能够为研究CML的发病机制和治疗药物提供协助.本研究在逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型的基础上建立了更加省时、高效且易于监测病程和鉴定疾病类型的方式，成功建立了容易监测及鉴定的BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠

模型，为CML的机制和药物研究提供了一个良好的平台.

1资料和方法

1.1材料

1．1．1载体和试剂

pMSCV-BC/ABLI-lRES-GFPpkat-ampac逆转录病毒包装载体由本实验室保存.5-Fluorouracil（5-Fu,Cat#6627）、HEPES^polybrene来自Sigma.抗小鼠Gr-1-APC（Cat#553129）流式抗体来自BD.SCF、lL-3、lL-6来自Peprotech.

1.1.2实验动物

6〜10周龄的C57BL/6小鼠购买并饲养于西安交通大学医学部

SPF级动物房.

1.2方法

1.2.1pMSCV-BR/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒的制备

用293T细胞培养基（DMEM培养液含有10%FBS1%T链霉素，200mM谷氨酸和1%MEMnon-essential氨基酸）将293T细胞于10cm培养皿培养至密度为80%寸，利用pMSCV-BC/ABL1-lRES-GFP逆转录病毒载体转染293T细胞，48h后收集pMSCV-BR/ABL1-IRES-GFR逆转录病毒上清液立即使用或储存－80．

1．2．2采集和体外培养供者小鼠骨髓细胞

要求供者和受者小鼠属于同一品系．通常情况下，10只供者小鼠

可提供2〜3107骨髓细胞.第1天，取6〜10周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，尾静脉注射0.6mL5-Fu/只，按200mg/kg计算.第4天时，处死小鼠获取4〜6107骨髓细胞，将供者骨髓细胞分为两等分，即实验组和对照组，用48mL骨髓细胞刺激培养基（含有77%DMEM20%FBS1%青链霉素，200mM谷氨酸，18ng/mL小鼠重组IL-3,20ng/mL小鼠重组IL-6以及100ng/mL小鼠重组SCF）分别悬于两个六孔板中，在CO2培养箱内培养24h.

1.2.3pMSCV-BR/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒感染供者小鼠骨

髓细胞

第5天，向实验组的六孔板加入pMSCV-BC/ABL1-lRES-GFP逆转录病毒第一次转染骨髓细胞培养基（含有50%pMSCV-RCABL1-lRES-GFR逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3,20ng/mL小鼠重组IL-6,100ng/mL小鼠重组SCF1%HEPE和20卩g/mLpolybrene），每孔2mL对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL轻柔混

匀后，室温2300rpm离心90min,继续在CO2培养箱中培养3〜4h.室温下1500rpm离心10min,丢弃上清液，各加入24mL骨髓细胞刺激培养基,过夜培养.第6天,向实验组的六孔板加入pMSCV-BRC/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒第二次转染骨髓细胞培养基（含有50%pMSCV-RC/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3,20ng/mL小鼠重组IL-6,100ng/mL小鼠重组SCF,1%HEPE和

20[1g/mLpolybrene）,每孔2mL悬浮第一次转染后的骨髓细胞，向对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL,轻柔混匀后，室温

2300rpm离心90min,CO2培养箱培养3h.最后用Hank's缓冲液悬浮两组骨髓细胞，准备注射受者小鼠.

1.2.4致死量射线照射受者小鼠并实行骨髓移植

第6天，采用医用电子直线加速器（英国Eiekta）照射6〜10周龄SPF级的C57BL/6小鼠12只，辐射剂量920cGy.将上述pMSCV-BR/ABL1-IRES-GFP逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为实验组，同样，将未使用逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为对照组，细胞用量为1106/0.4mL/只.SPF级动物房饲养移植后小鼠.每隔一天观察小鼠存活情况、称取体质量;每周采用流式细胞仪检测受者小鼠外周血GFP卩日性细胞数量，即代表表达BCR-ABL1的细

胞.大约15〜20d可建立BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型.

1.2.5BCR-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型的鉴定

1.2.5.1移植小鼠体质量和生存率监测

每隔一天称取并记录实验组小鼠和对照组小鼠的体质量，计算实验组小鼠和对照组小鼠的生存率.

1.2.5.2流式细胞仪检测

每周取移植受者小鼠内眦血于抗凝剂中，经红细胞裂解液裂解

8min去掉红细胞后，1PBS洗2次，检测外周血有核细胞中GFP白血病细胞的百分比并计数.将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠脾脏，尽快收集病鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，经红细胞裂解液裂解5min去掉红细胞后，1PBS洗2次，利用抗小鼠Gr-1抗体对移植受者小鼠的骨髓和脾脏细胞避光孵育20min,1PBS洗2次，1PBS悬起后流式细胞仪检测实行免疫分型.以Gr-1+GFP表示粒细胞白血病细胞.

1.2.5.3移植受者小鼠肺脏和肝脏HE染色

将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠肺脏和肝脏，将肺脏和肝脏组织标本经石蜡包埋，切片和HE染色后，显微镜下观察白血病细胞的浸润情况.

2结果

2.1移植小鼠体质量和生存率变化

将pMSCV-BC/ABL1-lRES-GFP逆转录病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给受照射后的C57BL/6受者小鼠作为实

验组，以接受同样剂量照射并移植未感染病毒的供者骨髓细胞的C57BL/6受者小鼠作为对照组，每隔一天称取体质量，监测小鼠体质量变化.因为致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠体质量表现照射性降低，随后在一周之内恢复体质量并且持续平稳，在移植后3周时，实验组小鼠体质量连续降低，而对照组小鼠体质量保持平稳（图1A），

C57BL/6实验组小鼠与C57BL/6对照组小鼠的体质量变化比较，差异具

有统计学意义（PV0.05）.

2．2移植小鼠外周血白血病细胞监测情况

C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓细胞后，每周取移植受者小鼠内眦血，监测受者小鼠外周血中GFP白血病细胞的水平.通过流式细胞仪检测后发现，C57BL/6实验组小鼠7d后外周血中即出现GFP+细胞（图2A），并且随着移植时间推移，GFP粒细胞明显增多（图2B）.至白血病细胞占外周血有核细胞80%寸，小鼠迅速死亡.C57BL/6对照组小鼠外周血中始终未出现GFP鈿胞.

2.3移植小鼠粒细胞白血病建模成功

骨髓移植20d左右时，实验组小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡、进食减少的状态（图3A）.当实验组小鼠体质量连续减轻且外周血白血病细胞持续增高时，处死实验组小鼠和对照组小鼠，观察肺脏、脾脏及肝脏，发现实验组小鼠脾脏较对照组体积增大显著，且出现肉眼可见大小不一数个白色突起（图3B），实验组小鼠肺脏表现出血、粗糙且布满白色点状结节（图3C），肝脏布满白色结节（图3D）.将肺脏和肝脏实行HE染色，观察到实验组小鼠肺脏和肝脏有大量白细胞浸润（图3E、3F）.将脾脏实行HE染色，同样观察到实验组小鼠脾脏有大量

白血病细胞浸润（图3G）,收集实验组小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，通过流式细胞仪检测发现脾脏中主要为大细胞（图3H），且脾脏中GFP鈿胞占有核细胞的90%（图3I），利用抗小鼠Gr-1抗体对实验组小鼠的骨髓和脾脏细胞实行免疫分型（以Gr-1+GFP+表示粒细胞白血病细胞），通过流式细胞仪检测发现脾脏中有核细胞的80%^GFP+Gr-1钿胞，进一

步证实是BCR-ABL1+粒细胞白血病.

3讨论

CML是一种因为粒细胞大量增生却失去分化水平的髓系增生性疾病，来源于造血干细胞并且因为含有致癌基因BCR-ABL而获得增殖快

速于正常造血干细胞的优势［7－8］，因为致癌基因产生的蛋白具有高度异常的酪氨酸激酶活性，持续活化其下游信号分子通路，促动了CML细胞的增殖和抗凋亡水平，造成CML细胞的恶性转化［9］.在CML进程中CML-BP（blasticphase）患者对酪氨酸激酶抑制性药物、异体造血干细胞移植、或者联合化疗效果均较差，死亡率极高

:

10］.此外，相对于CML-CP（chronicphase）期，CML-BP期基因组的复杂性和异质性均更高［11］.虽然酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对CML的治疗有革命性的突破，但是BCR-ABL1基因的突变产生了伊马替尼的耐药问题［12—13］.所以，研究BCR-ABL1+粒细胞白血病的发生、耐药机制以及新的药物对治疗CML至关重要.虽然我们能够利用CML细胞异体移植小鼠模型和BCR-ABL转基因小鼠模型来研究CML的发病机制，但是因为这些小鼠模型构建潜伏期较长，均不利于CML治疗药

物的研究.本研究利用逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型具有稳定且潜伏期短的优势，在其基础上对照射方式实