5RACE 和 3RACE.docx

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5RACE和3RACE

3'RACEPCR

3'RapidAmplificationofcDNAEnds（RACE）PCR

Thistechniqueisusedtoobtainthe3'endofacDNA,itrequiressomesequenceinformationinternaltothemRNAunderstudy.ThesequenceinformationobtainedfromthistechniquecanbeutilisedtoobtainfulllengthcDNAclonesusingthe5'RACEtechnique.

ThemethodI'veusedislooselybasedonthatgivenin'PCRprotocols:

Aguidetomethodsandapplications',AcademicPressInc.

TheprotocolgivenusesSuperScriptIIreversetranscriptase（LifeTechnologies）andTaqpolymerasefromBoehringerMannheim.Youwillneedtoadjustthereagentsaccordingtotheenzymesyouuse.

Reagents:

Sterilewater（highpurity,RNase-free）

5xSuperScriptRTasebuffer（LifeTechnologies）

100mMDTT

2.5mMdNTPs

RNaseinhibitor（Pharmacia）

SuperScriptRTase（LifeTechnologies）

10xPCRbuffer（BoehringerMannheim,contains15mMMgCl2）

500mMdNTPs

Mineraloil

RNA:

BothtotalandpolyARNAaresuitableforthistechnique.IrecentlycomparedthetwoandfoundthepolyARNAreactiontohavetheedge,butonlyjust.IdorecommendusingpolyARNAfor5'RACEthough.

Primers:

-

T17Adapterprimer（T17AP）:

GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT

Adapterprimer（AP）:

GACTCGAGTCGACATCG

Genespecificprimer:

Designedfromknownsequence,ideallyitshouldan18-22-merwithanannealingtemperatureofaround56℃,whereaG/C=4℃andanA/T=2℃.

cDNA3’末端的快速扩增（3’-RACE）

反转录：

1、转移1pg至100ng的poly（A）+RNA或1ug总RNA到一只新的离心管。

用水调整体积至9ul。

将RNA样品在75℃变性5min，将离心管插入冰中冷却。

2、向这种含有已变性的RNA样品的离心管内一次加入如下试剂：

5×扩增缓冲液10ul

20mmol/L4种dNTP混合液（ph8.0）1.5ul

10umol/L（dT）17-接头引物（80pmol） 8ul

约20单位/ul胎盘Rnase抑制剂1ul

100-200单位/ul反转录酶1ul

H2O补足至50ul

反应管温育在37℃反应60min，设置3支阴性对照管。

在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。

这些对照管进行所有后续的实验步骤。

设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。

3、用TE（PH7.6）将反转录产物（cDNA）稀释至终体积为1ml。

扩增：

4、按以下次序，将各成分加入在一直0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立PCR系列反应管：

已稀释cDNA0-20ul

10×扩增缓冲液5ul

20mmol/L4种dNTP混合液5ul

10umol/L（dT）17-接头引物（16pmol）1.6ul

10umol/L接头引物（32pmol）3.2ul

10umol/L基因特异性正义寡聚核苷酸引物（32pmol） 3.2ul

1-2单位热稳定DNA聚合酶1ul

H2O补足至50ul

5、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油,防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。

如果应该热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。

放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。

按以下方法进行PCR扩增。

典型的程序有变性、复性和聚合；相应的循环条件与温度列表如下：

循环数

变性

复性

聚合

首轮循环

94℃5min

50-58℃5min

72℃40min

后续循环（20个）

94℃40s

50-58℃1min

72℃3min

末轮循环

94℃40s

50-58℃1min

72℃15min

6、抽提每种扩增样品5-10ul，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断片段的大小。

凝胶一般用EB或SYBR金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

7、若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结果后可用150ul氯仿抽提去除。

8、从扩增的DNA产物中分离掉残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP。

cDNA5’末端的快速扩增（5’-RACE）

方法：

反转录：

1、转移1pg至100ng的poly（A）+RNA或1ug总RNA到一只新的离心管。

用水调整体积至9ul。

将RNA样品在75℃变性5min，将离心管插入冰中冷却。

2、 向这种含有已变性的RNA样品的离心管内一次加入如下试剂：

5×扩增缓冲液4ul

20mmol/L4种dNTP混合液（ph8.0）1ul

10umol/L基因特异性反义引物14ul

约20单位/ul胎盘Rnase抑制剂1ul

50mmol/LMgCl21ul

100-200单位/ul反转录酶1ul

H2O补足至20ul

反应管温育在37℃反应60min，设置3支阴性对照管。

在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。

这些对照管进行所有后续的实验步骤。

设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。

反转录产物的纯化：

3、去除过剩的寡核苷酸或随机六核苷酸引物可用水将反应液终体积稀释至2ml，然后用Centicon-100微量浓缩器。

离心转速为500-1100g（2000-3000r/min，用SorvallSS34转头），温度在4℃和25℃之间离心20min。

重复用水稀释步骤和离心步骤。

转移潴留的液体到一支新的0.5ml离心管，用旋转真空抽干机使体积浓缩至10ul。

4、加入10ul体积的如下试剂至反转录cDNA样品中：

5×末端转移酶缓冲液4ul

1mmol/LdATP4ul

末端转移酶10-25单位

反应管孵育在37℃水浴中反应15min。

5、 在80℃放置3min使末端转移酶灭活。

使带有dA尾的cDNA样品用TEph7.6稀释至终体积1ml

扩增：

6、按以下次序，将各成分加入在一直0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立PCR系列反应管：

已稀释cDNA0-20ul

10×扩增缓冲液5ul

20mmol/L4种dNTP混合液5ul

10umol/L（dT）17-接头引物（16pmol）1.6ul

10umol/L接头引物（32pmol）3.2ul

10umol/L基因特异性引物2（32pmol）3.2ul

1-2单位热稳定DNA聚合酶1ul

H2O补足至50ul

7、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油,防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。

如果应该热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。

放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。

8、 按以下方法进行PCR扩增。

典型的程序有变性、复性和聚合；相应的循环条件与温度列表如下：

循环数

变性

复性

聚合

首轮循环

94℃5min

50-58℃5min

72℃40min

后续循环（30个）

94℃40s

50-58℃1min

72℃3min

末轮循环

94℃40s

50-58℃1min

72℃15min

9、 抽提每种扩增样品5-10ul，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断片段的大小。

凝胶一般用EB或SYBR金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

10、若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结果后可用150ul氯仿抽提去除。

11、从扩增的DNA产物中分离掉残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP。

RACE技术-cDNA的获得

通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。

通过PCR和克隆的方法。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。

2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。

这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。

不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。

在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。

但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。

3、进行如下的热循环：

94度30秒

25个循环：

（1）94度5秒

（2）72度2－15分钟

4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。

例如：

预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。

注意：

如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。

5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。

通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。

6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。

不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。

7、将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。

8、利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。

注意：

应该尽量减少紫外对cDNA的照射。

9、利用胶回收试剂盒回收cDNA。

此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。

如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。

10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。

通过克隆产生全长的cDNA：

1、如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。

2、利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。

利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。

3、在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。

RACE的扩增原理图

RACE技术-引物设计

基因特异性引物（GSPs）条件是：

1、23－28nt

2、50－70％GC

3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2）.由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。

并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。

只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。

在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。

随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

11、验证基因特异性引物的对照：

单个引物的阴性对照：

只用一个引物GSP来进行阴性对照。

这样不应该产生任何的条带。

如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。

利用两个GSPS进行阳性对照：

（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。

）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。

可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。

如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。

纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。

非哺乳动物的mRNA应略小。

RACE技术的分类和发展史

RACE（rapid-amplificationofcDNAends）是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。

RACE的扩增原理图

RACE技术-主要分类：

一般分5-和3-RACE两种。

3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物（根据已知序列设计）和PolyT引物PCR即可。

大多实验者反映一次PCR可以搞定。

5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。

其一为加接头（传统），根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。

另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。

还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。

RACE技术-发展历史：

RACE技术

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：

Schaefer，l995：

Chen，1998：

Bespalova等，1998：

Matz等1999）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：

改进之一是利用锁定引物（（lockdockingprimer）合成第一链cDNA,即在oligo（dT）引物的3′端引入 两个简并的核苷酸【5′-Oligo（dT）16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而 消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5‘端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h（60度-70度）有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进 之四是采用热启动PCR（hotstartPCR）技术和降落PCR（touchdownPCR）提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。

邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。

其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。

所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。

RACEPCR简介

基因特异性引物（GSPs）条件是：

1、23－28nt

2、50－70％GC

3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2）.由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。

并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。

只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。

在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。

随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

11、验证基因特异性引物的对照：

单个引物的阴性对照：

只用一个引物GSP来进行阴性对照。

这样不应该产生任何的条带。

如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。

利用两个GSPS进行阳性对照：

（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。

）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。

可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。

如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。

纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。

非哺乳动物的mRNA应略小。

RACE技术的分类和发展史

RACE（rapid-amplificationofcDNAends）是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。

RACE的扩增原理图

RACE技术-主要分类：

一般分5-和3-RACE两种。

3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物（根据已知序列设计）和PolyT引物PCR即可。

大多实验者反映一次PCR可以搞定。

5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。

其一为加接头（传统），根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。

另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。

还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。

RACE技术-发展历史：

RACE技术

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：

Schaefer，l995：

Chen，1998：

Bespalova等，1998：

Matz等1999）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：

改进之一是利用锁定引物（（lockdockingprimer）合成第一链cDNA,即在oligo（dT）引物的3′端引入 两个简并的核苷酸【5′-Oligo（dT）16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而 消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5‘端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h（60度-70度）有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进 之四是采用热启动PCR（hotstartPCR）技术和降落PCR（touchdownPCR）提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。

邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。

其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。

所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。

   随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术,谱克隆技术、等。

但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术（rapidampl