DNARNA合成常见问题解答.docx

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DNARNA合成常见问题解答

DNA/RNA合成常见问题解答

处理和保存

 1.如何保存寡核苷酸?

 2.如何重悬寡核苷酸?

 3.如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗?

 4.荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗?

纯化和浓缩

 5.如何定量合成的寡核苷酸?

 6.如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸?

 7.如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT,OD值是0.7，那

   么它的量是多少?

 8.如何计算寡核苷酸的分子量?

 9.如何测定寡核苷酸的质量?

10.如何测定寡核苷酸的质量?

11.如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?

12.为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?

13.用什么方法调整寡核苷酸的浓度?

14.单位换算表

合成与订购

15.如何合成寡核苷酸?

16.标准寡核苷酸结构

17.Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?

18.当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50nmol，为什么?

19.能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?

20.能提供寡核糖核酸（RNA）合成吗?

21.合成的寡核苷酸在3'或5'位有磷酸基吗?

22.简并引物及通用引物是什么?

纯化方法

23.怎样纯化合成的寡核苷酸?

24.用于芯片分析的60mer寡核苷酸如何被纯化呢?

修饰寡核苷酸

25.修饰寡核苷酸

26.作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸

实验

27.怎样制备双链DNA?

Q1.如何保存寡核苷酸？

                                                                                                ↑TOP

     通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。

寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。

若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。

另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。

Q2.如何重悬寡核苷酸？

                                                                                                ↑TOP

     为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液（10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0），而不用无菌水来溶解寡核苷酸。

重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。

寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。

Q3.如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？

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     脱水的寡核苷酸是长期稳定的。

即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况（没有引入使寡核苷酸降解的污染物）即使在室温中放置超过一星期也能使用。

Q4.荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？

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     如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。

为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。

由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰

Q5.如何定量合成的寡核苷酸?

                                                                                        ↑TOP

     合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。

通常通过测量紫外吸光度值（OD值）来定量。

Q6.如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？

                                                                   ↑TOP

     寡核苷酸的量经常用OD值来描述。

1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。

因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。

dT:

8.8ml/µmol

dG:

11.7ml/µmol

dC:

7.3ml/µmol

dA:

15.4ml/µmol

     对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。

它的浓度可通过下式来计算：

O.D.=εC（内径1cm的比色杯）

Q7.如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT,OD值是0.7，那么它的量是多少？

                                                                                                                             ↑TOP

首先，用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少：

ε=11.7×3+7.3×4+15.4×5+8.8×6=194.1（ml/mmole）

然后，通过下式来计算寡核苷酸的浓度：

O.D.=εC，C=O.D./εC

C=0.7/194.1=0.0036（µmol/ml）=3.6（nmol/ml）

最后，OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。

Q8.如何计算寡核苷酸的分子量?

                                                                                     ↑TOP

寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算：

M.W.=（NA×249.2）+（NC×225.2）+（NG×265.2）+（NT×240.2）+（寡核苷酸长度-1）×63.98+2.02

NA=总A数

NC=总C数

NG=总G数

NT=总T数

Q9.如何测定寡核苷酸的质量?

                                                                                        ↑TOP

     通常，合成的寡核苷酸的质量用摩尔数来描述，常用nmol。

用寡核苷酸的摩尔数或寡核苷酸的分子量可以计算寡核苷酸的量：

     寡核苷酸质量（ng）=分子量（M.W.）×摩尔数（nmol）

Q10.如果不知道寡核苷酸的碱基组成，有什么办法来定量合成的寡核苷酸？

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     1OD值的单链寡核苷酸大约33mg，双链寡核苷酸约为50.mg。

然而对于较短的寡核苷酸，上述值偏差较大。

因此，最好用Q6中提到的适合于短寡核苷酸质量的计算方法，可以得到更精确的结果。

Q11.如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?

                                                                           ↑TOP

     Tm（解链温度）是指50%双链被解开成单链时的温度。

寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。

Tm 值 有多  种计算方法。

我们使 用近 邻 法（PNAS 83,3746-50）来计算。

用这种方法计算前，也有多种方法来估测。

如果是15个碱基以下，那么有一种好的方法来估算，对于A和T，可以乘以2癈，对于C和G，可以乘以4癈然后相加，这叫做Wallace法则。

Tm=2℃（A+T）+4℃（G+C）

另一种方法来估计长链中GC含量

Tm=81.5+0.41（%GC）-500/L+16.6log[M]

（L:

寡核苷酸的长度；M:

1价阳离子的浓度）

     但这些方法不能消除碱基堆积的影响，结果并不准确，所以近邻法被广泛的应用。

但是，对于在60-70bp或15bp以下的寡核苷酸的测定，近邻法还是有缺点。

     Bioneer使用的近邻法具有新的特点。

它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响，并且通过热力学来测定，可以更有效的测定Tm值。

比如5'-GC-3'和5'-CG-3'的序列用热力学方法测定结果是不同的。

计算方法如下：

     依靠热力学方法，焓和熵通过两个碱基来确定。

[salt]是指一价阳离子的浓度，[Oligo]是指反应过程中的寡核苷酸浓度。

R是指气体常数（1.987cal·K-1mol-1）。

Bioneer用近邻法计算Tm值时，使用的是50mM的盐浓度和1nM的寡核苷酸的浓度。

     Bioneer会给每一个用户提供Tm值，但这只是估计值，我们不能保证精确性，因此这个值仅供用户参考。

如果没有扩增出产物，你可以把退火温度降到Tm值以下4～5癈。

如果有许多非特异性的产物，你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。

Q12.为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?

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     Bioneer使用的Tm值的计算方法和我们通常的计算方法是不同的。

我们通常只是简单的乘以A、G、C、T的数目，但序列不同碱基的Tm值亦会不同。

如Tm值取决于序列中的每一个碱基，即使碱基数相同但序列不同时，Tm值也将不同。

Q13.用什么方法调整寡核苷酸的浓度？

                                                                           ↑TOP

     首先，在Bioneer提供的数据表或报告单中的100pmol/靗，是用来加入TE缓冲液或无菌水，以使管中寡核苷酸的终浓度达到100pmol/靗。

例如,数据表或报告单中是189.0和209.2时，则应向两个管中分别加入相应量的无菌水,即可使每个管中的寡核苷酸浓度达到100pmol/µl。

每一个管中寡核苷酸含量通过下式可以计算如下：

189.0µl×100pmol/µl=18,900pmol=18.9nmol,

209.2µl×100pmol/µl=20,920pmol=20.92nmol

如果所要的终浓度是0.5µM，pmol/µl需要换µM。

100pmol/µl=100×106 pmol/106µl=100×106×10-12 mol/L=10-4 mol/L

=10-4 ×106µmol/L

=102µmol/L

=100µM

终浓度换算为100µM，如果需要的浓度是0.5µM的，加入终体积的1/200的引物量，以使引物终浓度为0.5µM。

PCR反应的终体积是50µl，所以需要加50/200=0.25µl的引物，以使终浓度达到0.5µM。

Q14.单位换算表                                                                                                           ↑TOP

科学系统单位:

 10-1=deci[d]

 101=deca[da]

 10-2=centi[c]

 102=hecto[h]

 10-3=milli[m]

 103=kilo[k]

 10-6=micro[m]

 106=mega[M]

 10-9=nano[n]

 109=giga[G]

 10-12=pico[p]

 1012=tera[T]

 10-15=femto[f]

 1015=peta[P]

 10-18=atto[a]

 1018=exa[E]

 10-21=zepto[z]

 1021=zetta[Z]

 10-24=yocto[y]

 1024=yotta[Y]

----------------------------

寡核苷酸单位换算的例子:

1pmol/µl

=1×10-12mol/1×10-6L

=1×10-6mol/L

=1µmol/L

=1µM

Q15.如何合成寡核苷酸?

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     目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通过使用“亚磷酸三脂”方法 将单体连接，形成天然 的3'-5'磷 酸 二 脂 键 。

Koster发现了β-氰乙基亚磷酰胺并作为构建单体，现在普遍的用于寡核苷酸的合成（Nucl.AcidsRes.1984,12,4539;TetrahedronLett.1983,24,5843）。

通过“亚磷酸三脂”的方法使用β-氰乙基亚磷酰胺，合成效率能够达到（98%）而合成时间比其它寡核苷酸的合成方法更短。

而且，由于单体β-氰乙基亚磷酰胺在激活以前很稳定，这是对合成寡核苷酸来说所必需的，他们能储存更长的时间。

当寡核苷酸共价的连接在固相载体上就可以使其不被过量溶解β-氰乙基亚磷酰胺和结合试剂的作用下，寡核苷酸被合成。

在各种各样的固相载体中，可控孔度玻片已经在近年广泛使用了，这种玻片是由均匀的玻璃基质组成，上面有固定尺寸的孔。

     整个寡核苷酸的合成通过一系列的反应完成，其中包括四个循环反应：

脱保护，连接，氧化，加帽。

脱保护

     通过第一个循环—脱保护，CPG裂解出5'保护基团DMT。

酸性条件对于脱保护是必需的，通常使用3％三氯乙酸。

据报道，寡核苷酸在酸性环境中易脱嘌呤，尤其是对于腺苷。

因为三氯乙酸有很强的酸性，所以用三氯乙酸脱保护时，反应时间不应该太长。

比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性较弱，能够在一些情况下避免脱嘌呤问题。

脱保护后产生的DMT阳离子呈现出一种深橘色。

通过测定吸光度，来监测反应效率。

连接

     脱保护后，CPG上的5'-羟基暴露，结合核苷β-氰乙基亚磷酰胺，三亚磷酸酯氧化变成磷酸三脂，然后按顺序连接。

对于核苷β-氰乙基亚磷酰胺，为了避免合成寡核苷酸过程中负反应的发生，碱基的环外氨基被保护以免形成酰胺结构。

苯甲酰基用于保护酰苷和胞苷。

另一方面，异丁酰基用于鸟苷碱基保护。

胸苷碱基中没有环外的胺基，所以不需要保护。

β-氰乙基亚磷酰胺用于保护所有核苷的5'-羟基。

     因为核苷2-氰乙基亚磷酰胺在正常条件下非常稳定，不能直接和正在合成链上游离的5'-羟基功能基团发生反应。

所以，它们必须首先通过一种弱酸性激活剂激活。

在各种激活剂中，四唑作为标准激活剂具有很强的激活作用。

四唑已经被认为具有双重作用：

它质子化2-氰乙基亚磷酰胺的二异丙氨基，产生亲核基团，形成具有活性的四唑膦中间产物。

用这种被激活的核苷亚磷酰胺试剂耦联反应快（不到2分钟），产量高。

氧化

     新合成的亚磷酸盐和核苷酸之间的键合不稳定，对酸和碱均很敏感。

因此，三价的亚磷酸三脂被氧化成五价的磷酸三脂。

碘是温和的氧化剂，在碱性的四氢呋喃溶液中作为氧的供体。

此步反应非常快，在三十秒内就可以完成。

加帽

     因为结合反应在特定的时间内不能够定量，在每一步结合反应中都有一小段提前终止的序列产生。

如果这些序列进一步参与反应，产物将很难从混合序列中分离出来。

通过加帽，即将自由羟基乙酰化，解决了这个问题。

乙酰化可由强的乙酰化试剂完成，该试剂是由等摩尔的醋酸酐和N-甲基咪唑组成，反应可在30秒内完成。

氧化后，核苷酸加入，循环完成。

寡核苷酸合成后，移去增长链5'-末端的DMT基团，下一个核苷酸的聚合循环开始。

整个寡核苷酸合成后，借助浓氨水的处理，寡核苷酸从固相载体上分离，同时碱基和磷酸基去保护。

Q16.标准寡核苷酸结构                                                                                                  ↑TOP

Q17.Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?

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合成量0.025µmol:

50mer

合成量0.05µmol:

50mer

合成量0.1µmol:

100mer

合成量0.2µmol:

100mer

合成量1.0µmol:

130mer

Q18.当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50nmol，为什么?

                                  ↑TOP

     50nmol的寡核苷酸合成不意味着能得到50nmol的最终产品。

50nmol是指在寡核苷酸合成开始时固相载体负荷的数量。

寡核苷酸通常是反应所要求的量而不是最终产率，用户得到的核苷酸的数量自然要比要求的少。

终产率受寡核苷酸长度、碱基组成和连接效率的影响。

Q19.能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?

                                                                   ↑TOP

     众所周知，含高百分比的“G”寡核苷酸不容易被合成，特别是序列中包含一行“G”。

有报道，如果有四个或更多的“G”排成一行，寡核苷酸将趋向形成鸟嘌呤四聚体（PoonandMacGregor,Biopolymers, 1998,45,427-434）。

通过次黄嘌呤核苷置换部分G，就能避免四聚体鸟苷的形成。

Q20.能提供寡核糖核酸（RNA）合成吗？

                                                                         ↑TOP

     是的，我们能合成。

我们能提供2'-OH或/和2-O-甲基结构的寡核糖核苷酸，也能合成由DNA和RNA组成的寡核苷酸。

Q21.合成的寡核苷酸在3'或5'位有磷酸基吗？

                                                                ↑TOP

     如果没有殊要求,合成的寡核苷酸在3'或5'端均无磷酸基。

如果你想要3'或5'有磷酸基的寡核苷酸，你应该在订单上标注清楚在3'或5'端进行磷酸化修饰。

Q22.简并引物及通用引物是什么？

                                                                                 ↑TOP

R<-a或g

Y<-c或t

M<-a或c

K<-g或t

S<-g或c

W<-a或t

V<-a,c或g

H<-a,t或c

B<-g,t或c

D<-g,a或t

N<-a,c,g或t

Q23.怎样纯化合成的寡核苷酸？

                                                                                    ↑TOP

     为了纯化合成的寡核苷酸，Bioneer采取了几种不同的方法如，脱盐，BioRP,HPLC及PAGE。

脱盐

     寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。

通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-氰乙氧基--酸二脂键的保护基团以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。

然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。

所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。

脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。

尽管脱盐纯化可以移除所有的非必需有机杂质，但它不能有效移除合成中产生的微量的（每个联结步骤中不超过2%）提前终止的寡核苷酸杂链。

不过，脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究的。

BioRP

     如果寡核苷酸合成以“三苯甲基”的形式完成，则N末端包含5'-DMT基团，而提前终止的寡核苷酸不包含该基团。

因为DMT基有强亲脂性，有5'-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂具有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用来进行寡核苷酸的纯化。

利用反向树脂和5'-DMT寡核苷酸间存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团这一原理，我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。

HPLC

     如果合成的寡核苷酸应用于克隆，定向突变或定量的基因检测，那么对其纯度要求较高。

脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，而HPLC纯化法被广泛地用于这个目的。

作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸的纯化。

阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。

反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。

因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35mer）。

PAGE

     对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶作为纯化基质。

尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。

Q24.用于芯片分析的60mer寡核苷酸如何被纯化呢?

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     我们推荐PAGE纯化法用于60mer寡核苷酸的纯化。

通常，长核苷酸（大于50mer）被推荐使用PAGE纯化法。

Q25.修饰寡核苷酸