白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究本科论文.docx

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白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究本科论文

学科分类号　0818

本科生毕业论文（设计）

题目（中文）：

白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究

（英文）：

Theresearchofwhiterottingfungiamberfungus＇sdegradationofthestraw

学生姓名：

　　　李健强　　　　　　　　

学　　号：

　　　0712401025　　　　　　

系　　别：

　　　生命科学　　　　　　　

专　　业：

　　　生物工程　　　　　　　

指导教师：

　　　刘胜贵　　教授　　　　

　　　邹　娟　　讲师　　　　

起止日期：

　　　2010.3-2011.5　　　　　

年月日

怀化学院本科毕业论文（设计）诚信声明

作者郑重声明：

所呈交的本科毕业论文（设计），是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。

除文中已经注明引用的内容外，论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。

对论文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确的方式标明。

本声明的法律结果由作者承担。

本科毕业论文（设计）作者签名：

年月日

目录

摘要…………………………………………………………………………………Ⅰ

关键词………………………………………………………………………………Ⅰ

Abstract……………………………………………………………………………Ⅱ

Keywords…………………………………………………………………………Ⅱ

1.1前言……………………………………………………………………………1

1.2半纤维素、纤维素、木质素结构………………………………………………1

1.3白腐真菌对木质素的降解…………………………………………………………3

1.4白腐真菌锁状联合………………………………………………………………4

2材料与方法………………………………………………………………………4

2.1材料与设备…………………………………………………………………5

2.1.1实验材料………………………………………………………………5

2.1.2实验药品………………………………………………………………5

2.1.3仪器设备………………………………………………………………5

2.1.4培养基…………………………………………………………………6

2.1.5实验药剂………………………………………………………………6

2.1.61mg/ml的葡萄糖标准液配制…………………………………………6

2.2实验方法……………………………………………………………………7

2.2.1菌种活化………………………………………………………………7

2.2.2白腐真菌琥珀骤木耳的菌落观察……………………………………7

2.2.3锁状联合观察…………………………………………………………7

2.2.4葡萄糖标准曲线制作…………………………………………………7

2.2.5稻草秸秆的固体发酵…………………………………………………8

2.2.6半纤维素、纤维素、木质素的测定……………………………………9

3结果与分析……………………………………………………………………10

3.1锁状联合观察………………………………………………………………10

3.2白腐真菌琥珀骤木耳菌落观察……………………………………………11

3.3葡萄糖标准曲线的绘制……………………………………………………11

3.4半纤维素、纤维素、木质素的含量………………………………………12

3.4.1半纤维素含量…………………………………………………………12

3.4.2纤维素含量……………………………………………………………16

3.4.3木质素含量……………………………………………………………19

4结论……………………………………………………………………………22

参考文献……………………………………………………………………………23

致谢…………………………………………………………………………………24

白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究

摘要

　　为了了解白腐真菌？

对半纤维素、纤维素、木质素的降解能力，本文使用了固态发酵的方法，测定了在不同培养条件下该菌种对稻草秸秆粉中的半纤维素、纤维素和木质素的降解能力。

并通过制作葡萄糖标准曲线和实验所测得的OD值，从而得知白腐真菌在四组不同温度（26℃，28℃，30℃，32℃）和四组不同的pH（2.5,3.5,4.5,5.5）下固态发酵，在温度为28℃、pH为3.5时，其半纤维素降解率达到23.60%，纤维素降解率达到15.24%，木质素降解率达到43.49%。

这是该菌种对稻草秸秆降解效果最好的条件。

关键词

白腐真菌；稻草秸秆；木质素；纤维素；半纤维素；降解

Theresearchofthewhiterottingfungiamberfungus’sdegradationofthestraw

Abstract

Cropstrawisaby-productofagriculturalproduction,andisalsoanimportantbiological;resources.Thespecialtyofitsstructuremakesithardtobreakdownwhichleadstheconversionbecomedifficult.Thisarticleisaboutthesedimentaryendoscopeofthewhiterottingfungiamberfungushypha,whichaimstocomprehenditsclampconnectionstructure.Andalsoitteststhedegradationoftheplantstover’shemicellulose,celluloseandlignininthedifferenteducationconditions.TheODvaluewhichhavegotbymakingtheglucosestandardcurveandtheexperiment.Weknowthatunderthefourdifferenttemperate（26℃,28℃,30℃,32℃）,pHvalue（2.5,3.5,4.5,5.5）andsolidfermentation,theresultindicatesthatpreferableresultofstraw’sdegradationisprocuredwhentheconditionsare30℃temperateandpHvalue3.5.Inthiscondition,thedegradationratioofhemicellulosewere23.60%,thecellulosewere15.24%andtheligninwere43.49%.

Keywords

whiterottingfungi;straw;lignin;cellulose;hemicellulose;degradation

1.1前言

农作物秸秆作为一种可再生资源,在我国具有分布广、数量大、种类多、价格低廉的特点。

如何充分利用这些资源而又使环境不受污染,是现代农业面临的难题[1]。

农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分组成,由于纤维素特别是木质素难以被分解,影响其利用推广。

近几十年来,国内外科研人员虽然研究了一些物理、化学的秸秆利用方法,但都存在着利用不充分、成本高等问题[2.3]。

实践表明,秸秆的生物法利用是最佳途径,此法具有降解率高,安全环保,成本低等优点。

国内外近年来就如何提高白腐菌木质素降解酶的产量做了大量工作[4],但过去的研究主要集中于白腐菌的液体培养、产酶条件的优化选择及该菌去除废液中木质素的工艺控制[5],对于白腐菌固态发酵情况下降解固态木质素的研究较少。

所以,科学合理地探寻白腐菌固态发酵的最佳条件并利用其处理固态木质素具有一定意义。

1.2半纤维素、纤维素、木质素结构

禾本科植物秸秆的半纤维素结构主要是聚木糖，即聚阿拉伯糖基-4-0-甲基葡萄糖醛酸木糖,其典型分子是以1-4β苷键连接的D-吡喃型木糖基为主链,在主链的C-3和C-2上分别连有L-呋喃型阿拉伯糖基和D-吡喃型葡萄糖酸基作为支链。

图1是麦草秸秆中的半纤维素结构。

图1从压力精磨的小麦秸秆中分离的半纤维素的假设结构

Fig.1AtentativechemicalstructureofhemicelluloseBextractedfrompressure-refinedwheatstraw

纤维素则是由若干个β—葡萄糖构成的，葡萄糖单元之间以β—1,4苷键结合而形成的长链大分子物质，分了不分支。

图1.2纤维素分子中β—葡萄糖的结合

纤维素是由许多葡萄糖分子单元连接而成的高分子化合物，其葡萄糖以β—1,4苷键型缩合而成的。

此外，他们彼此以氢键相连，尽管氢键的键能比一般的化学键能小得多，但因氢键的数目多，这些氢键构成巨大的氢键网格,直接导致了致密的晶体结构的形成。

致密的晶体结构严重阻碍了化学试剂或者生物酶与纤维素表面的有效接触和作用,这也正是天然纤维素非常难于水解的重要原因。

木质素分子中不像纤维素那样有单一结合形式,化学结构非常复杂。

一般认为木质素的基本结构单元是苯丙烷,共有3种基本结构:

愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和对羟苯基丙烷,如下图1.3所示。

图1.3木质素的三种基本结构单元

Fig1.3Threebasicstructuralunitsoflignin

这些结构单元之间通过醚键和C—C键连接在一起形成具有三维体型结构的天然酚类无规聚合物。

1.3白腐真菌对木质素的降解

在木质素的自然降解中，降解能力最强的是白腐菌，此外还有褐腐菌、软腐菌以及细菌。

白腐菌为丝状真菌，因腐生在木材上引起木材的白色腐朽而得名。

白腐菌对木质素的降解主要通过三种酶来完成：

木质素过氧化物酶（Ligninperoxidase，LiP）、锰过氧化物酶（Manganese-dependentperoxidase，MnP）、漆酶（laccase，Lac）。

迄今为止，利用LiP，MnP和漆酶作用木质素仍是木质素降解的最主要手段。

LiP是一系列含Fe、卟啉环和血红素附基的同工酶，能以H2O2为电子受体氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物。

电子传递体攻击木质素时，它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化成自由基，然后以链式反应产生许多不同的自由基，导致木质素分子中主要键断裂。

MnP也是血红素过氧化物酶，能够氧化酚型木质素，MnP在H2O2的启动下，氧化Mn2+为Mn3+，然后后者进一步氧化各种酚型化合物。

漆酶是最早被发现的木质素降解酶，大多分布在担子菌（Basidimycetes），多孔菌（Polyporus），柄孢壳菌（Podospora）等中。

漆酶是以O2为电子受体的含铜单电子氧化酶。

其作用是使固体木质素的羧基增加而成为水溶性的状态，易于接受后续酶的作用，漆酶同时还有解聚木质素的作用。

白腐真菌能够选择性降解木质素、纤维素和半纤维素，其降解能力因相关影响因素而异。

本文通过对白腐真菌琥珀骤木耳的研究和它对稻草秸秆中木质素、纤维素、半纤维的降解实验，找到它最适合降解稻草秸秆的温度、pH等，从而充分发挥其作用，使其对降解半纤维素、纤维素、木质素等方面提供一定的理论依据。

1.4白腐真菌锁状联合

担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间处生一个短小弯曲的分枝，核移动，一个核进入钩，一个留在菌丝。

两个核分裂后，钩中保留一个核，菌丝中二个核一往前一个往后移，钩状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构称锁状联合。

锁状联合的意义：

保证每个菌丝细胞内都含有两个不同性别的核。

为进行有性生殖，通过核配形成担子打下基础。

2材料和方法

2.1材料与设备

2.1.1实验材料

实验菌种：

白腐真菌琥珀骤木耳

稻草：

来自五楼微生物实验室

2.1.2实验药品

磷酸二氢钾（天津市石英钟厂霸州市化工分厂）、无水乙醇（分析纯、湖南汇虹试剂有限公司）、磷酸氢二钠（分析纯，天津石英钟厂霸州市化工分厂）、氢氧化钠（分析纯，广东汕头市西垅化工厂）、氯化钠（分析纯，成都市金山化工试剂厂）、硫酸镁（分析纯，广东汕头市西垅化工厂）、丙酮（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）、琼脂粉（生化试剂，湖南汇虹试剂有限公司）。

2.1.3仪器设备

ZHWY211B卧式恒温震荡摇床、SIGMA3K-18型离心机（德国SIGMA公司生产）、QYQ-1000-UL／QYQ-200-UL移液枪（北京青云航空仪表有限公司生产）、CJ型水平层流净化工作台（苏州洁净技术研究所制造）、SL-PHS-3E酸度计、MC15-9X2-12电炉、海尔BCD-215KA冰箱、FA2004电子天平、752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SW-420-2S恒温水浴锅（金坛市新航仪器厂）、CS101-1E（B）电热鼓风干燥箱（中外合资重庆四达实验仪器有限公司）、DHP-2000电热恒温培养箱、马福炉、粉碎机、接种铲、培养皿等。

2.1.4培养基

PDA培养基：

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，水1000ml，自然pH。

固态发酵营养液[6]：

葡萄糖10.0g，酒石酸钾钠（C4H4O6KNa4·H2O）2mmol，吐温202.0g，醋酸缓冲液10mmol（pH5.0），磷酸二氢钾3.0g，VB11mg；微量元素组合液：

硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.5g，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0.2g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.2g，硫酸铜（CuSO4.5H2O）15mg，无水氯化钙0.4g，愈创木酚1.0g，自来水1000mL，备用。

取四分已经配好的固态发酵营养液50ml，用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调节pH值，调节四组不同pH值：

pH值2.5、pH值3.5、pH值4.5、pH值5.5的营养液。

然后121℃，20min灭菌备用

2.1.5实验药剂

中性洗涤剂的配置：

称取18.6gEDTA、6.8gNa2B4O7放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30gSDS和10ml乙二醇乙醚。

再称取4.56g无水Na2HPO4置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释定容至1000ml，其中PH值约为6.9-7.1。

[7]

2M盐酸溶液：

167ml浓盐酸（比重1.19）用蒸馏水定容至1000ml。

72%浓硫酸溶液：

665mlH2SO4（比重1.84）加入300ml水中，冷至20℃，补加水至1000ml。

2.1.61mg/ml的葡萄糖标准液。

将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100ml小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100ml容量瓶中用蒸馏水定容至100ml，充分混匀。

4℃冰箱中保存备用。

2.2试验方法

2.2.1菌种活化

（1）配制PDA培养基100ml，装入250ml锥形瓶中，和培养皿一起于121℃灭菌20min。

（2）灭完菌后，趁热，在超净工作台上倒5个PDA平板。

（3）等平板冷却后，用接种铲在保存有菌种的试管斜面铲取少许菌种，接种到PDA平板中央，然后把接种后的平板置于28℃的恒温培养箱中培养。

2.2.2白腐真菌琥珀骤木耳的菌落观察

一周后，从恒温培养箱中取出培养皿，观察该菌在PDA平板上的生长情况。

如该菌落的大小、形状、颜色、光滑程度等等。

2.2.3锁状联合观察

染色镜检。

在超净工作台上采用无菌操作，在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从真菌菌落边缘处挑取已产孢子的真菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心的将菌丝分散开。

盖上盖玻片，置低倍镜下观察，然后换高倍镜观察。

2.2.4葡萄糖标准曲线制作

用DNS法,在波长为540nm条件下,测定一系列已知样品,制备标准GLC曲线。

表2.1葡萄糖标准曲线的制作

Table2.1FactureofnormalcurveofGlucose

管号1mg/mL葡萄糖标准液/ml蒸馏水/mlDNS/ml葡萄糖含量/mg

10.02.01.50.0

20.21.81.50.2

30.41.61.50.4

40.61.41.50.6

50.81.21.50.8

61.01.01.51.0

取6支25mL具塞刻度试管编号，按上表加入浓度为1mg/mL葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS），配成不同葡萄糖含量的反应液。

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，放入水中冷却至室温，用蒸馏水定容至25ml，混匀，在分光光度计上进行比色。

波长540nm，用1号管样品调零点，测出光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，作标准曲线。

[8]

2.2.5稻草秸秆的固体发酵

（1）粉碎。

将稻草秸秆于80℃干燥箱中干燥，然后用粉碎机粉碎，用60目筛子过筛。

（2）稻草粉灭菌。

取8个250ml的锥形瓶，每个锥形瓶内加入稻草粉4g，然后121℃，灭菌20min。

（3）接种发酵。

在无菌工作台上，用移液枪往四个锥形瓶中加入5mlpH自然的固体发酵培养基，另外四个锥形瓶分别加入pH为2.5、3.5、4.5、5.5的固体发酵培养基。

分别接种三个菌片，贴上标签。

然后分别于26℃，28℃，30℃，32℃的恒温培养箱中放上pH自然的固体培养基锥形瓶培养，其余4个pH不同的锥形瓶置于28℃的恒温培养箱中培养。

2.2.6半纤维素、纤维素、木质素的测定

（1）5天后，在无菌条件下，分别称取发酵的稻草秸秆粉0.5g，至于150ml的锥形瓶中，加入20ml中性洗涤剂，100℃保温1h，过滤，残渣用水、丙酮洗。

滤液弃去，残渣备用。

（2）半纤维素含量测定【9-12】：

将上述残渣置于150ml锥形瓶中，加入20ml2M盐酸溶液，100℃保温50min，过滤，水洗残渣至pH6.5-7.5。

取9支洗净烘干的25ml具塞刻度试管，编号后在1号试管中加入2ml蒸馏水作为空白对照。

在另外8支试管中分别加入2ml不同温度、不同pH的滤液，再向每支试管中各加入1.5mlDNS溶液，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀。

以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定其他8支试管的光密度值（OD值）并记录结果，对照葡萄糖标准曲线从而得到还原糖含量，乘上系数0.9得到半纤维素含量。

（3）纤维素含量测定：

将第三步制备的残渣用丙酮洗两次，60℃干燥，加入5ml致冷的72%硫酸,20℃水解3h后加入45ml蒸馏水,室温过夜,次日用蒸馏水洗残渣至pH6.5。

取9支洗净烘干的25ml具塞刻度试管，编号后在1号试管中加入2ml蒸馏水作为空白对照。

在另外8支试管中分别加入2ml不同温度、不同pH的滤液，再向每支试管中各加入1.5mlDNS溶液，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀。

以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定其他8支试管的光密度值（OD值）并记录结果，对照葡萄糖标准曲线从而得到还原糖含量，乘上系数0.9得纤维素含量。

（4）木质素含量测定：

将第四步残渣于80℃烘干，称重（W）后在550℃灰化，得灰分（W1），木质素含量=W-W1。

（5）每隔5天取一次样，重复以上步骤，总共取6次样。

3结果与分析

3.1锁状联合观察

把用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色的菌丝用显微镜观察，下面是其锁状联合结构。

图3.1白腐真菌的锁状联合结构（10×40）

Figure3.1Thelockofwhiterotfungijointstructure（10×40）

通过该菌种的锁状联合的观察，确定了该菌种为担子菌。

3.2白腐真菌琥珀骤木耳菌落观察

菌种活化一周后，观察该菌种形成的菌落，其菌落图片如下：

图3.2白腐真菌菌落图片

Figure3.2Picturesofwhiterotfunguscolony

经过观察发现，该菌种形成的菌落直径有2-3厘米，为白色绒毛状，向四周生长，挑取菌种时发现不易挑取。

3.3葡萄糖标准曲线的绘制

于540nm波长下，以空白对照调零点后测得其各管溶液的光密度值并记录结果如下表3.1所示。

根据表3.1数据，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，使用Origin作图软件在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线图3.1。

其中，葡萄糖量由公式y=0.5308x-0.0086，推出x=（y+0.0086）/0.5308，x即为葡萄糖量，单位（mg）。

表3.1葡萄糖标准曲线测定结果

Table3.1Determinationresultsofstandardcurveofglucose

管号空白12345

葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.0

光密度（OD540nm）00.1480.3650.5500.7230.871

3.4半纤维素、纤维素、木质素含量

3.4.1在不同时期半纤维素的含量变化（%）

在温度为26℃，28℃，30℃，32℃时,经过固体发酵后，稻草秸秆粉里面半纤维素含量变化如下：

表3.2半纤维素含量（%）与温度关系表

Table3.2hemicellulosecontentandtemperaturerelationshiptable

温度

0天

5天

10天

15天

20天

25天

30天

26℃

18.52

18.26

16.54

15.75

15.35

14.82

14.56

28℃

18.52

18.05

16.23

15.45

15.06

14.61

14.33

30℃

18.52

18.19

16.45

15.64

15.21

14.75

14.48

32℃

18.52

18.34

16.76

15.89

15.52

15.02

14.81

图3.4半纤维素含量（%）与温度关系图

Figure3.4hemicellulosecontent（%）versusTemperature

在pH为2.5，3.5，4.5，5.5时,经过固体发酵后，稻草秸秆粉里面半纤维素含量变化如下：

表3.3半纤维素含量（%）与pH关系表

Table3.2hemicellulose