分子生物学电子教案第四章.docx

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分子生物学电子教案第四章

第四章DNA的复制

第四章DNA复制 （DNA Replication）

1．主要内容

1） DNA复制概览

2） 细菌DNA复制

3） 真核DNA复制

2．教学要求

1） 掌握原核生物和真核生物DNA的复制特点

2） 熟悉原核生物和真核生物DNA复制的酶系统

第一节DNA复制概述

第二节DNA复制的酶学

第三节原核生物DNA复制

第四节真核生物DNA复制

第一节DNA复制概述（DNAReplication:

AnOverview）

一、基本概念

二、DNA的半保留复制

三、复制起点、方式和方向

四、DNA复制的半不连续性

一、基本概念

 复制子（Replicon，复制单位或复制元）

 DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。

1.3万—90万不等

  AunitofthegenomeinwhichDNA contain aregionfromorigintoterminator

 复制体（Replisome）：

复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。

 Themultiprotein（30±）structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

二、DNA的半保留复制

（Semi-ConservationReplication）       

CsCl（Cesiumchloride）densitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超离心）

 LabeledE.ColiDNAwith15N 14N

  三、复制起点、方向和方式

• AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprisesinglereplications.（单复制子）

1、复制起点（origin，ori或O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置

原核生物（Prokaryote）：

单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位

真核生物（Eukaryote）：

多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位

  2、复制方向（复制过程的顺序性）

复制叉（Replication fork）：

染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点

复制眼（replication eye）：

电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛

真核生物的多复制子  多个复制眼

（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉

（2）复制的多模式

单起点、单方向（原核）

多起点、单方向（真核）

单起点、双方向（原核）

多起点、双方向（真核）

 3、复制方式

（1）从新起始（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）

（2）置换式（Displacementform）又称D环复制

（3）共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rolling circlereplication）

DNA复制方式

（1）从新起始（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）或θ复制

 AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.

（2）置换式 Displacement form，又称D环复制

 线粒体和叶绿体DNA的复制方式

（3）共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rolling circlereplication）

由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制

病毒、细菌因子

四、DNA复制的半不连续性

（Semi-DiscontinuousReplication）

复制方向的问题：

 冈崎片段（Okazaki fragment）

 1968年冈崎（ReijiOkazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilse－labelingexperiment）。

冈崎利用T4噬菌体侵染E.cili（t-）菌株，并分别用dTTP（3H-T）进行2’’，7’’,15’’,30’’,60’’,120’’的脉冲标记，分离提取T4噬菌体DNA，变性后，进行Cscl密度梯度离心，以检测具放射性的沉降片断，判断片断大小。

结果表明经不同标记时间的，被3H-T标记的新合成的DNA片段几乎都为10-20s，即均为1000-2000核苷酸大小（图3-）。

第二组实验是脉冲追踪实验（pulse－chaseexperiment），为了研究在脉冲标记实验中所发现的10－20s的小片段在复制全过程中的发展结局，冈崎将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分钟，分离DNA进行密度梯度离心，发现小片段已被连接成为70－120S的大片段。

为此将DNA的这种复制方式称为不连续复制模式，将最初合成的10－20s片段称为冈崎片段（图3－）。

如果两条极性单链的DNA复制均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链暴露到1000－2000核苷酸长度后，开始从5’→3’合成冈崎片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按冈崎片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。

换言之,DNA的复制应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续复制的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续复制的方式完成冈崎片段的合成。

但在Okazaki的脉冲标记实验结果中，被标记的DNA全部为小片段。

其实在E.coli的细胞内存在dUTP和dTTP两种类似物,其比例大约为1：

300，而DNA聚合酶III又不能区分这两者，一旦将dUMP聚合到DNA分子中，必然会导致生物的基因表达与进化过程中的潜在危险，实际上E.coli依靠了两种机制阻止了dUMP掺入到DNA分子的过程。

由dut基因编码的dUTP酶（dUTPase）能有效地将dUTP，dUDP分解为dUMP,从而避免了dUMP作为底物而掺入到DNA分子中。

即使dUTPase能将绝大部分的dUTP降解，但仍有约1／1200的几率dUTP分子的逃逸，细胞内的ung基因编码的尿嘧啶－N－糖苷酶（ungase）可以迅速地将已经掺入到DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinic

或apyrimidinic），再由Ap内切酶进一步将Ap位点酶解成缺口，以与其对应的亲代链为模板重新聚合和连接，完成切补修复过程.

显然在先导链合成的初期过程中，约1200个核苷酸就有一个dUMP被切除的可能，在Ap内切酶未完全作用前提取DNA并进行变性分析，就会得到与冈崎片段相似大小的1000－2000核苷酸的片段，这种片段也被称为dUMP片段，Okazaki对dut－和ung－两种突变体的研究结果证实。

在dut－突变体的脉冲标记实验中，由于dUMP掺入的几率增加，冈崎片段变短。

而在ung－突变体的脉冲标记实验中，由于已掺入的dUMP被切除的几率降低，冈崎片段变长。

冈崎选用连接酶突变体（lig-）进行的脉冲追踪实验中，先导链的dUMP片段均不能被连接成大片段，（图3－）。

进一步证明了在脉冲标记实验中后随链的冈崎片段与先导链的dUMP片段均以相似大小表现在其研究结果中。

1978年Olivera据此提出了DNA复制的半不连续模式。

第二节DNA复制的酶学（Enzymology  of DNAReplication）

 复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与.

DNA复制的体系

底物：

dNTP（dATP  dGTP dCTP dTTP）

聚合酶（polymerase）:

 DNA-pol    依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP）

模板（template）:

解开成单链的DNA母链

引物（primer）:

寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合

其它酶和蛋白质因子:

解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶

一、DNA聚合酶

二、DNA连接酶（DNALigase）

三、与DNA几何学性质相关的酶

一、DNA聚合酶

催化dNTP聚合到核酸链上的酶。

是DNA复制的主要酶。

全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent  DNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNA polymerase），均缩写为DDDP。

（一）DNA聚合酶催化的反应

       5´→3´的聚合活性

       5´→3´外切酶活性

       3´→5´外切酶活性

 1、5´至3´的聚合活性

  催化四种dNTP以磷酸二酯键一个一个地接到DNA链上去

      （dNMP）n+dNTP→（dNMP）n+1+PPi

聚合反应的特点：

（1） 以单链DNA为模板

（2） 以dNTP为原料

   （3） 引物或DNA链提供3´-OH

   （4） 聚合方向为5´→3´

2、3’－5’ 外切核酸酶活性

     校对功能（proofreading）

3、5’－3’外切核酸酶活性

（二）原核生物的DNA聚合酶（E.coli） 

 1957  Arthur  Kornberg首次发现

 Infact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyon3

 DNApolⅠ

 DNApolⅡ

 DNApolⅢ

1.DNAPolymeraseI

2.DNAPolymeraseⅡ和Ⅲ

 DNApolⅡ：

5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。

 DNApolⅢ:

由10个亚基组成，分别为α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。

是原核生物体内真正起复制作用的酶。

– α亚基：

5`→3`聚合酶活性

– ε亚基：

3`→5`外切酶,校对和编辑

– θ亚基为装配所必须

亚基决定了Pol– III全酶的持续合成能力

3.三种大肠杆菌DNA聚合酶特性之比较

三种大肠杆菌DNA聚合酶的主要功能

 DNApolⅠ----主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复。

 DNApolⅡ----是主要的修复酶

 DNApolⅢ----是主要的复制酶

三种DNA聚合酶在决定DNA合成方面的共同特性

①三种酶都只有５’→３’聚合酶的功能，而没有３’→５’聚合酶功能，说明DNA链的延伸只能从5’向3’端进行。

②他们都没有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下进行链的延伸，因此，DNA的合成必须有引物引导才能进行。

③三种酶都有核酸外切酶的功能，可对合成过程中发生的错误进行校正，而保证DNA复制的高度准确性。

为什么子链DNA延伸方向只能是5’→3’

二、DNA连接酶（DNALigase）

催化单链DNA切口上5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键

三、与DNA几何学性质相关的酶

（一）解螺旋酶（helicase）

 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。

只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。

 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。

作用是利用ATP供能，解开DNA双链。

 复制相关蛋白的基因：

dnaA、dnaB、dnaC……dnaX

 相应的表达产物蛋白质：

DnaA、DnaB、DnaC……DnaX

 　DnaA：

辨认复制起始位点

 　DnaB：

解螺旋酶

  　DnaC：

辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。

（二）DNA拓扑异构酶（topoisomerase）

 拓扑：

是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。

 拓扑异构酶：

是一类可改变DNA拓扑性质的酶。

对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。

拓扑异构酶I（topoI）

－蛋白。

 在原核生物曾被称为

 主要作用是切开DNA双链中的一股，使DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛状态再封闭切口。

    反应不需要ATP

拓扑异构酶II（topoII）

• 在原核生物又叫旋转酶（gyrase）。

• 能切断DNA双链，使螺旋松弛。

在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接断端。

TopoI和TopoII松弛DNA负超螺旋

（三）单链DNA结合蛋白（SSB）:

 在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位。

 SSB与解开的DNA单链紧密结合，

  ①防止重新形成双链，维持模板处于单链状态；

  ②免受核酸酶降解。

表4参与DNA复制的酶及蛋白质

酶或蛋白质 主要作用

拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引进负超螺旋

解链酶类 解开DNA双链

单链DNA结合蛋白 维持已解开单链DNA的稳定

引物酶 合成RNA引物

DNA聚合酶Ⅲ DNA复制

DNA聚合酶Ⅰ 水解引物、填补空隙、修复作用

DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接

小结

1、基本概念    DNA复制  复制子 复制体 复制时期

2、半保留复制 

3、复制起点：

结构特征

  复制方向：

复制叉 复制眼 单双向复制的决定条件 复制的多模式

  复制方式：

复制叉式（从头起始）

            D环复制（置换式）

            σ复制（滚环复制）

4、复制酶学

1）三种DNApol   DNApolⅠ和Ш的主要活性和功能    聚合活性   外切活性（两种）       延伸方向

2）DNA连接酶

3）和DNA的几何学性质相关的酶

    螺旋酶  旋转酶    

5、DNA复制的半不连续性

     实验证据   先导链     后随链

4.3BacterialDNAreplication

 4.3.1 Initiation（起始）

 4.3.2 Elongation（延伸）

 4.3.3 TerminationofDNAreplication

4.3.1  Initiation（起始）

• Studysystem:

theE.colioriginlocusoriCisclonedintoplasmidsto    producemoreeasilystudiedminichromosomes.

• Initiationisdividedintothefollowingsteps:

– 1.recognitionoftheorigin（识别原点）

– 2.separationofparentalstrandsandstabilizationofsinglestrands（分开双链，稳定单链）

– 3.initiationofdaughterstrandsynthesisthroughactionofthePRIMOSOME（通过引发体起动子代链的合成反应）

HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.coli?

• 假定每个染色体都在同样的一个起始点（i）开始复制，那么距i近的基因将先被复制而复制得多些，远离i的基因将复制得少些。

因此在一个群体中离i点越近的基因出现频率越高。

• 假如复制是

– 单向的，基因频率呈单向梯度

– 双向的，基因频率以i为中心呈双向梯度

HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.coli?

  测定了大肠杆菌染色体上很多基因的频率，发现以OriC基因附近为中心呈双向下降。

Whatdoesthisexperimentshow?

• Thereisasingleplaceonthechromosomewherereplicationstarts

• Replicationproceedsinbothdirections

• Thetworeplicationforksmeetatnear31’onthegeneticmap

ThestructureofOriC

OriC

Howisreplicationinitiated?

• DnaAproteinbindsto9-mers（9nt聚合体）

• DnaAtogetherwithHU类组蛋白denaturetheDNA

• DnaBhelicase解旋酶bindstheopenDNA

InitiationofDNAreplicationinE.coli

1.initialcomplex（起始复合体）

• AlongwiththeHUprotein,thednaAprotein-ATPcomplexbindstotheDNA,encompassing包围thefournine-mers.Inall,thiscomplexcoversabout200bp.

（随同HU蛋白一起，dnaAprotein-ATP复合体结合到DNA上，包围4个9-mers区，总的覆盖200bp）

2.Opencomplex（开放复合体）和Preprimingcomplex（前引发复合体）

 DnaA蛋白使13bp重复单位熔解而形成开放性复合体，这一过程需要ATP。

 这时DnaB和DnaC蛋白进入DNA的熔解区与OriC结合形成前引发复合体。

 SeparatedstrandsintheoriCregionarepreventedfromreannealingbythebindingofsingle-strandedbindingprotein（SSBprotein）.

3.Theprimosomecomplexforms

• Ahelicase（DnaB）beginstounwindthestrands.

• SSBbindstopreventreannealing.

• Gyraserelievesthetension.旋转酶解除链的张力

• Primase引物酶synthesizesashortstrandofRNA.

• PrimasebindstodnaBproteinatoriCandformsaprimosome引发体.

Let’sreviewtherolesofthemajorplayers

• DnaA-Recognizesoriginanddenaturestheduplex

• DnaB-HelicasethatunwindstheDNA

• DnaC-RequiredforDnaBbinding

• HU-histone-likeproteinstimulatesinitiation

• Primase（DnaG）SynthesizesRNAprimers

• SSB-SinglestrandedDNAbindingprotein

• RNApolymeraseFacilitates促进DnaAactivity

• DNAgyraseRelievestorsional扭转的strain

• DammethylaseMethylatesGATCsequencesatoriC

ReviewInitiationofDNAreplicationinE.coli

1） oriCcontainsfour9bpbindingsitesfortheinitiatorproteinDnaA.SynthesisofDnaAiscoupled联系togrowthratesothatinitiationofreplicationisalsocoupledtogrowthrate.

2） DnaAformsacomplexof30-40molecules,facilitating促进melting解链ofthree13bpAT-richrepeatsequenceforDnaBbinding.

3） DnaBisahelicasethatusetheenergyofATPhydrolysis水解tofurthermeltthedouble-strandedDNA.

4） SSB（single-strandedbindingprotein）coatstheunwindedDNAtopreventDNArenaturing.

5） DNAprimaseloadto负担synthesizesashortRNAprimerforsynthesisoftheleadingstrand.

4.Primosome（引发体）:

DnaBhelicaseandDNAprimase

4.3.2 Elongation（延伸）

• ElongationinvolvesanothercomplexofproteinscalledtheREPLISOME（复制体，复制颗粒）.Itisassembledfromitscomponentseachtimereplicationoccurs.

E.colireplicationmachinery

（Elongationphase）

1）Helicase---unwindDNAatreplicationforkinareactioncoupledtoATPhydrolysis

2）Single-strandedDNAbindingproteins（ssb）---bindandstabilizetheDNAinasingle-strandedconformationaftermeltingbyhelicases

3）Primosome---synthesizesRNAprimersonlaggingstrand

4）DNAPolIII----thetrueE.colireplicase

5）DNATopoisomeraseII

– relaxessupercoile