吴乃虎《基因工程原理》46知识点总结.docx

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吴乃虎《基因工程原理》46知识点总结

第4章基因操作的主要技术原理

基因操作的方法包括:

大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。

DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。

一、核酸的分离和纯化技术

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。

DNA：

真核生物染色体DNA——双链线性；

真核生物的细胞器DNA——双链环状；

原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。

RNA：

RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。

一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。

DNA提取的目的

（1）可用PCR从基因组中扩增基因；

（2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系；

（3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因；

（4）作酶切图谱，用于DNA测序。

（一）总DNA的提取

DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。

14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。

总DNA：

一般来说是指基因组DNA，即细胞核内的染色体DNA分子。

核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。

其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。

分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。

尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。

（1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则：

①防止和抑制内源DNase对DNA的降解；

DNase以Mg2+、Mn2+为辅助因子，只要加入一定

的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。

②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。

动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。

（2）DNA提取的主要操作过程

（3）DNA提取的主要问题及解决方法：

①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增；

多酚、单宁、色素等氧化所致。

提取液中加入抗氧化剂可使问题得到解决。

②DNA沉淀中混有大量多糖或RNA杂物；

电泳回收、梯度离心

③DNA降解，琼脂糖凝胶电泳上呈弥散状。

材料是否新鲜，试剂、器具是否灭菌

（二）质粒DNA的提取

1、质粒提取分三步进行

1、碱抽提法提取质粒DNA

原理：

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在碱变性条件下（pH=12。

6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4。

8的醋酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

步骤：

质粒DNA粗制品—

2、影响质粒DNA产量的因素

（1）受体菌株

一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株如DH5α。

endA基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ，它能使所有DNA双链解开。

所以不要endA基因。

（2）质粒拷贝数

直接决定DNA产量的重要因素之一，质粒本身的性质所决定。

（3）质粒大小

分子量大的质粒，拷贝数少。

（三）RNA的分离

从细胞中分离的RNA的纯度与完整性对分子生物学实验至关重要，如Northern杂交分析、选择分离mRNA、cDNA合成、体外翻译及mRNA差别显示技术分离基因等实验，在很大程度上取决于RNA的质量。

1、RNA酶

RNase不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。

2、RNA分离的关键因素：

（1）Rnase污染的主要来源；

（2）实验室中防止污染的有效措施。

3、注意事项：

控制潜在的RNA酶的活性

（1）实验用具的去RNA酶处理

①玻璃器具：

180℃烘烤8h，或更长。

②塑料制品：

0。

1%焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡（37℃，2h）或室温过夜，120℃灭菌。

③电泳槽：

氯仿/NaOH冲洗或3%H2O2和0。

1%DEPC处理的水浸泡。

（2）H2O：

0。

1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制

部分试剂不能用DEPC处理，如Tris，

（3）其他

4、RNA酶抑制剂

（1）人胎盘RNase抑制剂；

（2）氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）；

（3）硅藻土（吸附RNase）。

5、RNA的抽提和纯化

（1）常用RNA分离方法：

①异硫氰酸胍；②盐酸胍-有机溶剂法；③氯化锂-尿素法；④一步热酚抽提法

异硫氰酸胍和苯酚

异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

酸性苯酚可促使RNA进入水相，而当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚进入有机相。

因此离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。

水相层（无色）—RNA；

有机层（黄色）—DNA和蛋白质；

细胞中RNA含量：

rRNA（80~85%）（28s，18s，5s）

tRNA（10~15%）

mRNA（1~5%）

6、mRNA的纯化

（1）由于真核生物mRNA的3’端有一个poly（A）尾，可用亲和层析的方法纯化；

（2）层析柱可用于mRNA的纯化。

RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。

若有降解可能是操作不当或污染了RNase。

28S和18SRNA比值约为2：

1，表明RNA无降解。

如比值逆转，则表明RNA降解。

（四）核酸的定量和纯度测定

1、紫外光谱法

原理：

DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰OD=1。

0时，dsDNA=50ug/ml；ssDNA=40ug/ml；RNA=40ug/ml；寡核苷酸=33ug/ml。

核酸分子中含有碱基使核酸在260nm下有最大吸收。

紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，含有嘌呤和嘧啶的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。

2、琼脂糖凝胶电泳估计

溴化乙锭（EB）能插入DNA或RNA分子的碱基之间，300nm紫外光照射下能发红色荧光，与已知浓度的DNA/RNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA/RNA含量。

DNA浓度计算公式：

根据浓度计算DNA总量：

DNA总量（μg）=DNA浓度（μg/μl）×体积（μl）

DNA分子量的估计：

一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知DNA分子量（Marker）。

如DNA的HindⅢ/EcoRI酶切物等。

核酸纯度计算：

蛋白质由于含芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光，通常蛋白质在280nm波长有特异吸收。

因此核酸在A260及A260、A280测定的比值（A260/A280）可以反映样品中核酸的含量及纯度。

RNA在A260/A280的比值在2。

0以上；

DNA在A260/A280的比值为1。

8左右。

当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

3、DNA片段的纯化（从琼脂糖）

（1）低熔点琼脂糖凝胶电泳法

（2）透析袋电洗脱法（回收5kb以上的DNA片段）

（3）GlassMilk（bead）结合法

3MNaI，硅珠（glassbead），洗涤

（4）Qiagen纯化柱

二、电泳技术

电泳：

带电物质在电场中向相反电极移动的现象。

在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基团是离子化状态的，DNA或RNA分子亦称多聚阴离子。

核酸分子在电场中是向阳极泳动的；在一定电场强度下，核酸分子的迁移率与分子量成反比。

这是凝胶电泳分离核酸的基本原理。

1、分类最小分辨率

（1）琼脂糖凝胶电泳100bp

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳1bp

（3）脉冲电泳10mb=107bp

1000Bp=1kb；1000kb=1mb

2、DNA电泳影响因素

主要与DNA分子特性和电泳条件有关。

（1）DNA分子大小:

线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。

（2）分子构型：

超螺旋DNA＞直线DNA＞开环双链环状DNA

（3）琼脂糖凝胶浓度

（4）电场强度:

小于5v/cm

分类

1、琼脂糖凝胶电泳

凝胶的种类：

常熔点，低熔点（65℃以下）

电泳缓冲液：

TAE、TEB

凝胶电泳指示剂：

溴酚蓝、二甲苯氰

DNA显色剂：

溴化乙锭

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

优点：

分辨率极高；载样量大；回收的DNA样品纯度极高；紫外吸收率低，机械强度高。

3、脉冲电泳（PFGE）

应用脉冲电泳可以成功地分离分子量高达107bp（10MB）的DNA大分子。

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。

这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大，不能分离DNA。

如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。

脉冲电泳是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使DNA在微观上按Z字型向前泳动，从而达到分离相对分子量大DNA片段的目的。

三、分子杂交技术

核酸杂交技术属于基因诊断技术的一种，应用于揭示DNA中是否存在某一特定序列。

原理:

根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的，在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交成双链分子。

根据检测样品的不同分为:

1、Southernblotting——DNA

2、Northernblotting——RNA

3、Dot-blotting——DNA

4、insituhybridization（细胞原位杂交、染色体原位杂交）

5、Westernblotting——蛋白质

（一）SouthernBlot

原理：

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：

检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态，如是否有扩增等。

步骤：

预杂交前：

（1）酶切

（2）电泳/照相（3）变性/中和（0.4NNaOH变性，1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）中和）（4）转移：

方法：

毛细管，电转移，真空转移buffer：

SSC（5）固定（6）预杂交等后续步骤

4、探针的标记

探针：

在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。

将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。

用作检测的核酸片段即为探针。

5、标记物及其检测

（2）Northernblotting

定义：

将RNA分子从凝胶转移到硝酸纤维膜上进行核酸杂交的方法。

原理：

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：

检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

主要对RNA进行定量和定性分析

步骤：

RNA凝胶电泳—转膜——探针标记——杂交

（3）

菌落或噬菌斑原位杂交

（4）Dot-blotting

斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southernblotting的基础上发展起来的两种快速检测特异核酸分子核酸杂交技术。

（四）Westernblot

与Southern杂交相似，在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA，所用的探针是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。

用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。

四、DNA序列分析

DNA核苷酸序列分析技术是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发展起来的一门重要的DNA技术。

至今，已成为DNA分子克隆研究中最重要的方法之一。

主要方法和技术：

（1）Maxam-Gilbert化学修饰法

（2）Sanger双脱氧链终止法

（3）DNA序列分析自动化

（一）、Maxam-Gilbert化学降解法

基本原理：

将一个DNA片段的5’端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5’端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列，通过直接或间接特异性识别4种碱基

Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂

常用化学试剂：

（2）Sanger双脱氧链终止法

5’

读互补的碱基

3’

（三）DNA片段序列分析的策略

¥Primerwalking

¥随机测序

¥通用引物测序（定向测序）

经典测序方法的反应步骤

模板变性—退火—标记—延伸—电泳分析和数据读取

1、序列分析的方法

（1）手动测序

（2）PCR测序

注意两点：

①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。

因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果来很大的干扰甚至造成结果无法识读。

②测序引物的Tm值适当高一些。

现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。

选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

（3）全自动测序

一次测序反应一般可读出500-800bp，若待测序的DNA片段较大，需从多处不同的位置引导测序反应。

核酸序列的生物信息分析

（一）序列分析和生物信息学的应用

1、基因序列的信息分析

两种序列的比较；基因编码领域，启动子序列的预测；蛋白质序列的氨基酸顺序的确定；

2、新基因的发现

通过分析EST（ExpressedSequenceTag）序列，结合DNAChip技术寻找新基因

3、根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。

（二）基因数据库和分析工具

基因数据库：

美国的GenBank，欧洲的EMBL，日本的DDBJ等

基因拼接及结构分析：

DNAman；DNAstar；VectorNT1；Geneious

核酸序列同源性分析：

NCBI

基因功能注释及表达分析：

NCBI

选程序Blastp就能查出含有的保守功能域和同源序列。

五、基因芯片

（一）生物芯片的定义

生物芯片：

是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

（二）生物芯片的分类

1．按载体材料

玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯

2．按点样方式

 原位合成芯片 、矩阵芯片 、电定位芯片

3．按芯片固定的生物分子类型

基因芯片或DNA芯片、蛋白质芯片、芯片实验室

4．按芯片使用功能分类

测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片

（三）基因芯片

基因芯片：

利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条DNA探针。

由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列。

在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（cDNA或cRNA）就与相应的探针杂交。

由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。

经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。

1、基因芯片技术的特点

核心是微型化：

高通量——提高信息量

平行化——提高信息的可比性

微量化——降低样品用量

自动化-——提高工作效率

2、基因芯片技术的发展史

3、操作流程

4、基因芯片的杂交及结果分析

通过分析杂交位点及其信号强弱，就可得出不同情况下每个基因是否已表达及表达多少。

5、基因芯片的应用

1．基因表达分析；2．基因型及多态性分析；

3．杂交测序；4．核酸和蛋白质相互作用的研究；

5．疾病的诊断与治疗；6．药物开发；

7．在营养与食品卫生领域的应用；

8．在环境科学领域中的应用。

遗传病诊断芯片：

地中海贫血分类芯片；唐氏综合症产前诊断芯片；HLA分型芯片；RH血型检测芯片

六、基因定点诱变

基因定点诱变：

利用DNA重组技术，在体外对DNA片段某个碱基进行特异性改造的技术

。

定点诱变的重要性应用：

1、研究基因的结构与功能；

2、获得突变体蛋白，开展催化机理、底物特异性和稳定性分析。

（一）体外突变的方法：

盒式诱发突变；寡核苷酸引物诱变；PCR诱变。

1、盒式突变

盒式突变：

利用一段人工合成的具有突变序列的双链DNA取代野生型基因中的相应序列。

2、寡核苷酸引物诱变

用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后，这段寡核苷酸引物便成为新合成DNA分子链的一个组成部分.新链具有已发生突变的碱基序列.

引物要求:

（1）与靶DNA的适当链互补，不能与其它部分进行杂交；

（2）足够长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25个碱基的长度

（3）错配碱基位于中间位置

3、PCR定点诱变

利用人工合成带突变位点的引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。

（1）大引物PCR诱变

（2）重叠延伸

七、研究DNA与蛋白质相互作用的方法

DNA的复制、重组、转录与修饰都涉及特定的DNA区域与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。

这一研究不仅分析参与基因表达调控的DNA元件，还可分离和鉴定同这些元件结合的特异蛋白质因子。

这对揭示环境因子与发育信号是如何表达控制基因转录活性具有重要意义。

（一）酵母双杂交系统

酵母双杂交体系：

也称为interactiontrap是九十年代初期在转录因子结构基础上发展起来的一种以酿酒酵母为表达系统，来检测蛋白质相互作用的体系。

它可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的另一种蛋白质的编码基因。

1、酵母双杂交体系的基本原理

2、应用范围

3、凝胶阻滞实验

4.DNaseI足迹实验

第五章PCR技术原理

一、基本要素和扩增原理

1、概念

PCR：

指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。

2、实验原理

基本原理是依据细胞内DNA复制的机理，以及体外DNA分子变性、复性，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。

3、主要步骤

（1）变性：

将待扩增的DNA置于高温下使之解链；

（2）复性（退火）：

人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；

（3）延伸：

DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’向3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

重复1~3步25~30轮，目的DNA片段扩增100万倍以上

二、PCR反应体系

1、缓冲液（buffer）10x

10mMTris·HCl，pH为8.3-9.0

1.5mMMgCl2

50mMKCl

2、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）

dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。

（1）dNTP浓度取决于扩增片段的长度；

（2）四种dNTP浓度应相等；

（3）浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量；

一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。

3、寡核苷酸引物

即人工合成的与模板DNA互补的寡核苷酸链

（1）引物浓度0.1-0.5mol/L

（2）浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。

（3）从引物3’端开始，5’3’方向延伸

（4）退火温度（Tm）=4（G＋C）＋2（A＋T）

a.简并引物

需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。

这样的混合引物称简并引物

如　ＡＣＴ／Ｃ　ＧＡＴ／Ａ

b.嵌套引物:

引物设计：

1、方法

2、引物设计的原则

（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。

（2）引物的长度：

一般长为15-30bp

（3）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构，如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC

（4）注意减少Primer间互补序列，导致2个Primer形成二聚体（dimer），一般不要超过3个互补bp如：

（5）G+C含量：

尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。

尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3’末端的重复排列。

（6）引物的3’末端最好是G或C，但不要GC连排。

（7）Primer5’未端可修饰、突变

修饰：

如：

32P、生物素、荧光素，不影响其效果

突变：

注意：

绝不可以在3'端进行上述改造

∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

（8）primer5’端增加碱基

①内切酶识别点：

（要加保护碱基）

（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG

↑保护bp

保护碱基对PCR产物cloning有很大好处，便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同（可用NNNN表示）。

如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆

②ATG起始密码

③TAA、TAG、TGA终止密码

4、模板

（1）纯度（PCR对模板DNA的纯度要求不高）；

（2）模板的量：

用人类或哺乳动物基因组DNA进行扩增时，一般使用1μgDNA，相当于单拷贝基因有3×105个拷贝。

其他如细菌、酵母等，100μl反应体系中100ng足够。

5、DNA聚合酶

功能：

a具有5’　3’聚合作用

　　　b具有5’　3’核酸外切酶活性

激活剂与抑制剂：

对金属离子的性质和浓度较敏感，如Mg2+

MgCl2——辅助酶发挥作用

KCl——使合成速度提高50%－60%

（1）最适聚合酶温度72℃，选择72℃延伸

（2）浓度:

0.5—2.5U/50μl

（3）酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。

（4）类型

 ①TaqDNA聚合酶

具有5’—3’合成活性