截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选硕士学位论文.docx
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截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选硕士学位论文
学校代号10731学号092077905016
分类号R284密级
硕士学位论文
截短侧耳素高产菌株
重离子诱变及高通量筛选
TheStudyofHeavyIonBeamBreedingandHigh-throughputScreeningofPleuromutilin-high-productionStrains
by
ZHAOXiaobin
B.E.（HuazhongAgriculturalUniversity）2008
Athesissubmittedinpartialsatisfactionofthe
Requirementsforthedegreeof
MasterofScience
in
PharmaceuticalScience
inthe
GraduateSchool
of
LanzhouUniversityofTechnology
Supervisor
ResearcherLiangJianping
兰州理工大学
学位论文原创性声明
本人郑重声明：
所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
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学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权兰州理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
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涉密论文按学校规定处理。
作者签名：
日期：
年月日
导师签名：
日期：
年月日
目录
摘要I
AbstractIII
第1章绪论1
1.1工业微生物制药技术概述1
1.1.1菌种的获得1
1.1.2高产菌株的选育2
1.1.3菌种保藏技术2
1.1.4发酵工艺条件的确定3
1.1.5发酵产物的分离提取3
1.2截短侧耳素国内外研究现状4
1.2.1截短侧耳素简介4
1.2.2截短侧耳素的结构与活性4
1.2.3截短侧耳素产生菌及其选育6
1.2.4截短侧耳素的发酵7
1.2.5截短侧耳素的提取8
1.3重离子辐照微生物育种9
1.3.1重离子加速器与重离子束概述9
1.3.2重离子辐照在微生物育种中的应用11
1.4微生物发酵过程优化与响应面法实验设计12
1.5高通量技术与微生物筛选14
1.5.1高通量技术概述14
1.5.2高通量技术在微生物育种中的应用15
1.6本研究的主要内容与意义17
第2章重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌18
2.1材料与方法18
2.1.1菌种18
2.1.2仪器18
2.1.3培养基与培养方法18
2.1.3辐照样品的处理19
2.1.4辐照方法及剂量的选择19
2.1.5菌种的保藏19
2.1.6辐照诱变后致死率和致死剂量的确定19
2.1.7截短侧耳素含量测定方法19
2.2结果与分析20
2.2.1贯穿辐照截短侧耳素产生菌的致死率20
2.2.2注入辐照截短侧耳素产生菌的致死率与致死剂量21
2.2.3注入辐照后存活菌株的正突变率21
2.2.4注入辐照诱变高产菌株的筛选22
2.3讨论23
第3章截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化24
3.1材料与方法24
3.1.1菌种24
3.1.2培养基配方24
3.1.3仪器24
3.1.4产量分析方法24
3.2结果与分析25
3.2.1主要影响因素的确定25
3.2.2最佳发酵培养基的确定27
3.2.3优化培养基的验证29
3.3讨论29
第4章截短侧耳素高产菌高通量筛选方法的建立30
4.1材料与方法30
4.1.1菌种与培养30
4.1.2试剂与仪器30
4.1.3高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量31
4.1.4特征波长的确定31
4.1.5高通量测定方法标准曲线的绘制32
4.1.6常规发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定32
4.1.7高通量固体发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定32
4.1.8统计分析方法32
4.2结果与分析32
4.2.1高效液相色谱法中截短侧耳素标准曲线的绘制结果32
4.2.2Clitopiluspasseckerianus高通量固体发酵与常规发酵的比较33
4.2.3紫外检测方法特征波长34
4.2.4高通量检测方法的标准曲线35
4.2.5高通量检测方法的精密度35
4.2.6高通量检测与常规检测的比较36
4.2.7高通量筛选与常规筛选的比较37
4.2.8高产菌株产量的稳定性39
4.3讨论39
结论与展望41
参考文献43
致谢46
附录（硕士期间发表论文）47
摘要
截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等真菌担子菌Clitopiluspasseckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。
以截短侧耳素为起点人工合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。
原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。
选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。
前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopiluspasseckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用。
优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。
截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。
基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下：
1.重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌
兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。
本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。
得到了碳离子诱变Clitopiluspasseckerianus的最适诱变方式和最适剂量为离子注入辐照40Gy，为进一步利用碳离子辐照诱变Clitopiluspasseckerianus提供了一定的理论依据，并筛选出一株截短侧耳素高产菌株K40-3，摇瓶效价达到16120μg/mL，较出发菌株提高25.3%。
2.截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化
本研究利用响应面法对碳离子辐照诱变后筛选得到的高产菌株K40-3进行了摇瓶发酵条件优化，并借助于SAS软件进行试验设计与数据分析，得到的最佳发酵条件为葡萄糖5.0%、大豆油0.33%、酵母粉0.6%、玉米浆3.0%、MgSO40.035%、CaCO30.05%、初始pH6.9、装量35mL/500mL△，截短侧耳素效价达到24750μg/mL，在初始发酵条件的基础上提高了53.7%。
3.高通量截短侧耳素产生菌筛选方法的建立
近年来发展起来的高通量技术，由于具有微型化、高效化、低廉化的各种特点，非常适合应用于高产菌株的筛选。
前人在高通量筛选菌株的研究中已做了大量的工作，建立了多种工业微生物微量培养和高通量产物检测方法，但并没有适合于Clitopiluspasseckerianus的微量培养方法与产物快速检测方法。
本研究成功建立了截短侧耳素产生菌Clitopiluspasseckerianus的微量固体发酵方法和高通量效价检测方法，二者结合筛选截短侧耳素高产菌株，可以快速测定一批待测菌株的效价，替代常规摇瓶发酵菌种筛选，可大大提高截短侧耳素产生菌的育种效率，为截短侧耳素产生菌的进一步菌种筛选工作奠定了良好的基础。
关键字：
截短侧耳素；重离子辐照；响应面法优化；高通量筛选
Abstract
Pleuromutilinisakindofdoubleterpenoidantibioticfromfungal,Clitopiluspasseckerianus.Itisanactivesubstanceagainstpenicillin-streptomycin-resistantstaphylococci.Pleuromutilinclassantibioticshaveexcellentantibacterialactivityandtheyareknownasapowerfulweapontofightagainstdrug-resistant.Thebenefitsofthepleuromutilindevelopmentareobvious;therearemanyantibioticsofpleuromutilinclasslistedintheallstudystages.Sothedemandforthepleuromutilinantibioticswillincrease.Andtheproductionofpleuromutilinslowedthedevelopmentspeedofpleuromutilinclassantibiotics.Inthisstudy,pleuromutilin-productstrainisimproved.
Themattersmustbeconsideredinthebreedingofhigh-productionstrainsarethemethodofmutagenicity,theoptimizationoffermentation,themethodofscreening.Previoususedavarietyofmutagenesismethodstobreedhigh-yieldstrains,butClitopiluspasseckerianusisakindoffungianditsabilitytorepairitselfisgood,generalmutagenisnotsuitableforitsbreeding.Tooptimizethepleuromutilinfermentationconditions,previoususedsingle-factortestororthogonaltest.Thenumberoftrialsislarge,andtheresultswereunabletofindthebestcombinationoffactorlevels.Thebreedingofpleuromutilinhigh-productionstrainistime-consumingandheavyworkload,whichlimitsthedevelopmentofpleuromutilin.Themethodofquickscreeningisinurgentneed.Then,themethodsofthisstudyare:
1.HeavyIonIrradiationbreedingpleuromutilin-productionstrain.
Becauseofthehighenergy,strongmutageniceffects,andthemutationcannotberepaired,theheavyionbeamgeneratedbyHIRFLinInstituteofModernPhysics,ChineseAcademyofSciencesenergy,isusedinthemicrobialmutagenesismoreandmore,andtheresultsaregood.Inthisstudy,heavyionirradiationbreedingmethodsisusedtobreedClitopiluspasseckerianusforhigh-productionstrains.Theoptimumdoseofionimplantationirradiationis40Gy.Andahigh-productionstrainK40-3isobtained.TheproductionofK40-3is16120μg/mL,increasedby25.3%.
2.ResponseSurfaceMethodoptimizationoffermentationconditionsofpleuromutilinproductionstrains.
TheexperimentwasusedresponsesurfacemethodtooptimizeClitopiluspasseckerianusfermentationconditions.AccordingtoResponseSurfaceMethodology,theoptimalcultureconditionsisglucose5.0%,soybeanoil0.33%,yeastextract0.6%,cornsteepliquor3.0%,MgSO40.035%CaCO30.05%,initialpH6.9,loadedamount35mL/500mL△.Thehighestproductionwas24750μg/mL.Itisincreasedby53.7%thantheoriginalmedium.
3.TheestablishmentofHigh-throughputscreeningmethodofpleuromutilinhighproductionstrain.
Becauseofitsminiaturization,highefficiency,low-cost,thehigh-throughputmethoddevelopedinrecentisverysuitableforthescreeningofhigh-productionstrains.Thistrendwillshortenthebreedingtime.Inthisstudy,anewmethodofhigh-throughputscreeningforthehigh-yieldpleuromutilinstrainswasestablished.Anumberofpleuromutilinstrainstobescreenedcanbequicklydeterminedwiththismethod,greatlyshortensthetimeneededinthestrainimprovingprocess.
Keywords:
pleuromutilin;heavyionirradiation；responsesurfacemethod;high-throughputscreening
第1章绪论
1.1工业微生物制药技术概述
工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。
工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。
欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中的重要地位。
微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。
微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素为：
是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。
近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。
但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性的次级代谢产物统称为微生物药物。
微生物药物的生产技术就是微生物制药技术，可以认为包括一下几个方面的内容。
1.1.1菌种的获得
菌种是工业微生物制药的关键，只有获得了良好的菌种，才能通过改进发酵工艺和设备，得到理想的产品。
目前工业生产上应用的优良菌种，无论是抗生素生产菌，还是其他活性物质生产菌，绝大多数都是从自然界中分离得到的。
如第一株应用于发酵工业的青霉素生产菌是从美国伊利诺斯州长霉的葡萄柚中分离出来；第一株头孢霉素生产菌则来自于意大利撒丁岛的污水中。
在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总得来说可以从以下几个途径进行收集和筛选：
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从总进行分离筛选。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
1.1.2高产菌株的选育
工业生产用菌株都是经过选育过的。
工业菌种的选育是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。
通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。
工业微生物育种方法包括诱变育种、代谢控制育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种等。
如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。
传统的人工诱变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种的选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。
诱变育种在抗生素工业生产上的作用更是无可比拟，几乎所有的抗生素生产菌都离不开传统的诱变育种的方法。
目前诱变育种仍是大多数工业微生物育种上最重要，而且最有效的技术。
1.1.3菌种保藏技术
工业微生物发酵所使用的菌种，几乎都是由低产的野生种通过人工诱变、杂交或基因工程育种手段获得的。
优良的性状往往在传代繁殖过程中不断地受到环境条件的影响，多数情况下会出现退化的现象。
为了使优良的性状得到最大程度的保存，根据退化出现的原因就要采取相应的积极手段进行菌种保藏和复壮。
由于微生物种类不同，各种生理生化特点也不同，对环境适应能力各异，保藏方法也不一样，通常分两大类。
一类是保藏时间较短的，如琼脂斜面、麸皮、大米斜面、液体石蜡斜面等，这些方法使菌种在保藏期间不能完全停止代谢活动，只能使代谢活动降至较低水平。
另一类是保藏时间较长的，如沙土法、冷冻干燥法、液氮法等。
这些方法使菌种完全处于休眠状态，代谢活动停止，很好的保持了其生理生化的潜在能力，一旦经过复苏活化，其典型的特征就表现出来。
菌种保藏要求不染杂菌，使退化和死亡降低到最低限度，从而达到保持纯种及其优良性能的目的。
1.1.4发酵工艺条件的确定
一个新筛选到的菌种不应马上应用于生产，应该通过大量实验进行一些重要发酵参数的研究。
目前在微生物发酵优化过程中最常用的优化方法有以下几种：
（1）单因素轮换优化设计，该方法只是讨论一种因素的影响，而忽视因素间的交互作用，这种方法并非总能获得最佳的优化条件。
（2）正交优化设计，这种方法注重如何科学合理的安排实验，而且可以同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平组合，但无法找到因素与响应值的数学表达式，即回归方程，同时也无法找到因素的最佳组合和响应值的最优值。
（3）响应面法，试验次数少、周期短、能够研究多因素间交互作用、精确求得因素与响应值的回归方程及预测最佳值。
与单因素设计和正交优化设计相比具有明显的优势，应用范围越来越广[1]。
1.1.5发酵产物的分离提取
发酵液中产物浓度往往都很低，抗生素为1%~3%，酶为0.2%~0.5%，维生素B12甚至只有0.002%的含量，且发酵液中可能含有理化性质类似的副产物和杂质，必须进行分离提取。
首先需要对发酵液进行预处理和过滤，一般预处理方法有酸化、加热、加絮凝剂等，可以除去发酵液中蛋白质和某些杂质；过滤可以从发酵液中分离出菌丝体，以获得澄清的发酵滤液。
其次对发酵液进行进一步的提取和精制。
提取方法一般有溶媒萃取法、沉淀法、离子交换法和吸附法等。
在精制时仍可重复或交叉使用提取的基本方法。
较多的产品精制时，常采用树脂脱色或活性炭脱色及去热原。
还可采用结晶及重结晶、晶体洗涤、蒸发浓缩、层析、无菌过滤、干燥等方法。
1.2截短侧耳素国内外研究现状
1.2.1截短侧耳素简介
截短侧耳素是由高等担子真菌Clitopiluspasseckerianus经过深层发酵产生的一种结构新颖的抗生素，1951年被首次分离并报道其活性。
由于偶然发现截短侧耳素衍生物具有更好的抗菌活性，后来开发上市的截短侧耳素类抗生素均为截短侧耳素衍生物，其中作为兽药已上市的先后有泰妙菌素、沃尼妙林
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