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硕士学位论文

硕士学位论文（选择其中一章）

菁染料在光学分子传感中的应用初探

摘要

由于具备了摩尔吸收系数大、荧光量子产率高、可用于红区测量、背景干扰

小等优点，菁染料在应用于分析测定时拥有较高的灵敏度及选择性。

因此，近年

来，菁染料探针分子的研究和开发已经成为研究的热点之一。

本人在前人工作的

基础上，继续拓展菁染料在小分子传感中的应用。

本论文共分五章。

现选择第一章进行研究。

Abstract

Bettersensitivityandselectivitywouldbeobtainedifthemeasurementisperformedbycyaninedyesforthefollowingreasons：

first，cyaninedyesthemselves

bearthemeritsoflargemolarabsorbability、highfluorescencequantumyieldandsoon；second，measurementcallbecarriedoutinnear-IRregionbyregulatingthelengthofmethylenechainandCallreducetheinterferencefrombackgroundeffectively．

Therefore，theinvestigationandexploitationofprobeofcyaninedyeshaveattractedmanyresearchers’attentionrecently．Inthisdissertation，1wouldcontinuetodeveloptheapplicationofcyaninedyesasopticalmolecularchemosensorsonthebaseofpreviousworkofpredecessor．Thisdissertationconsistsoffivechapterssummarizedasfollows．Inchapter1，Structurecharacters，classificationsandthecorrelationbetweenwavelengthandstructureofcyaninedyeswe托firstlysummarized．Thenintroducedvariousqualitiesandapplicationofthem，emphasiswasfocusedonaggregation、theapplicationinthedeterminationofnucleicacidsandprotein、theapplicationasoptical

molecularchemosensorsofthem．Finally,basedontheconcerningupdateddevelopments，theresearchobjectiveofthisdissertationWaspresented．

Keywords：

cyaninedyes；chemosensors；fluorescene；absorbance.

第一章绪论

第一节花菁染料的光谱性质及其分析研究进展

花菁染料的研究已有100多年的历史，早期其最重要的用途是作为光谱增感剂而应用于卤化银照相乳剂中，扩大卤化银微粒的感光范围并提高其感光度I¨。

因具有较大的摩尔吸收系数、相对较高的稳定性、反射率高、导热率小、熔点低、最大吸收波长可调谐范围大等特点，从被发现至今，花菁染料在其它各方面的应用也都陆续得到了长足的发展。

花菁是一类聚甲川类化合物，由于聚甲川链可以调节，这类化合物的光谱可从可见区一直延伸到近红外区（聚甲川链的长度和分子的吸收波长关系如表1．1所示）。

由于这类化合物的吸收波长可以调控，花菁已成为红区及近红外区

染料中最重要的一部分。

Tablel．1Therelationshipbetweenthemaximalabsorptionandfluorescence

wavelengthandthelengthof（CH=CH）mchainofsomecyaninedyes．

第一章绪论

这类化合物的通式如下：

；X一（CR）n—Y

Scheme．1Commonstructureofcyaninedyes．n=1、3、5⋯.

其中X和Y代表花菁分子的两个杂环端核，一般是由两个N原子中心构成：

其中一个N原子带正电荷，并与一个含奇数碳原子的共轭链相连，共轭链上碳原子再与另一个N原子中心相连。

这两个杂环端核通过共轭碳链（聚甲川链）构成具有“推一拉”电子结构特征的分子，人们据此也称花菁为“推一拉”烯烃。

在花菁分子中，若x和Y相同，则称为对称型花菁；若X和Y不同，则为不对称花菩。

从表1．1可以看出，聚甲川链的长度对花菁分子的最大吸收及发射波长有很大的影响：

一般而言，共轭碳链中每增加一个CH-CH键，该化合物相应的吸收和荧光波长均增加约100rim。

其它因素对花菁的吸收和荧光光谱也有一定的影响，如端核杂环及环上取代基团的电子布居性质等。

根据花菁聚甲川链单元所带的电荷不同，花菁染料可分为以下四种（相应结构如Scheme2所示）：

（1）阳离子聚甲川链一花菁和半花菁；

（2）阴离子聚甲川链一氧杂菁；（3）中性聚甲川链一部花菁；（4）两性的方酸菁。

一般情况下，花菁染料均以稳定的顺式构型存在，某些情况下也会发生光异构化。

这些存在形式可以借助各种技术手段进行研究，如闪光光解、瞬态吸收以及皮秒时间分辨荧光等【3，4l。

花菁染料的结构和光学特性决定了它具备其它染料所不及的功能及用途，在生物探针15·91、抗癌剂【lol、电子照相1111、LB膜【12l、光学非线性材料【131、

红外激光染料⋯以及光盘记录介质【15,16l等方面花菁染料都有着广泛而重要的应用和良好的发展前途。

1．1．2花菁染料的自聚集

在染料化学中，在溶液中或者固．液的介面上，很多染料分子通常会通过分子间强的范德华力发生自聚集现象。

花菁染料本身具有这种强的自聚集能力，许多情况下它不是以单体的形式存在，而是以聚集体的形式或者单体与聚集体混合物的形式存在于同一体系中。

依据吸收光谱的位移变化，人们提出了花菁在不同介质中所形成的各种各样的聚集模式，较常见的是红移的J．带聚集【17，18J和蓝移的H．带聚集【191。

一般认为，H．和J．聚集体分别是由平行的染料分子按面对面和头一尾相连的方式排列构成的二维染料晶体；其光谱的移动可用分子激子偶合理论【冽来解释。

根据激子理论，染料分子可当作一个点偶极，通过跃迁偶极的相互作用，染料聚集体的激态分裂成两个能级（见图1．1．）。

染料分子若以平行的三明治方式聚集，则形成H一二聚体；若以头．尾相连方式聚集，则形成J．二聚体。

形成H----聚体时的高态跃迁产生平行的跃迁矩（如吖啶橙），而形成J．二聚体时的低态跃迁产生垂直的跃迁矩（如1，1'-diethyl．2，2’-cyanineiodide，PlC），这两种情形分别导致了光谱的蓝移和红移。

花菁染料聚集体与单体的光谱性质存在很大差异，它们的光物理和光化学性质已被多人详细研究并将之广泛应用于卤化银照相乳剂中。

近年来科学家们继续拓展了花菁染料的聚集性质在其它方面的应用，如Strekowsld等人【22J合成了一系列长度不同的联二花菁染料（bis（hcptamethinccyanine），BHmC-n，n--4，6，8，10），并研究了它们在水溶液中的聚集情况。

作者根据聚集体与单体吸收及荧光光谱的区别判断出这些花菁染料在pH=7．2的水溶液中均以分子内二聚体的形式存在，当在溶液中加入人血清蛋白（HSA）时，花菁染料可以由聚集体向单体转化；且随着亚甲川链的长度不同，单体吸收及荧光恢复的程度亦不同，以BHmC-4的恢复程度最大

1．13花菁染料的分析应用研究进展

1．1．3．t花菁染料在生物分析中的应用研究

荧光探针已逐步取代具有放射性危害的同位素标记法，在生物技术领域中得到了重要应用。

用于生化研究的荧光探针应尽量满足如下条件【23J：

（1）

摩尔吸收系数大；

（2）良好的荧光性能；（3）较好的稳定性和溶解性；（4）易与被标示物通过物理或化学作用结合，标记反应残余物及副产物易于除去；（5）背景荧光干扰小；（6）标记反应条件温和；∽安全无毒。

20世纪80年代，荧光染料（主要为罗丹明和荧光素类）开始被应用于DNA自动测序中[241。

菁染料作为荧光探针与现有的其它荧光标记试剂相比具有以下优越性1241：

第一，这类染料种类繁多，光谱广泛分布在350nm到1200nm的区域内，具有很大的可比性及可选择性。

它们与生物分子键合后的活性衍生物可用于同时测试多种物质，这种多色或多参数分析对于简化操作、降低成本极为有利，且可提高复杂的混合体系中不同被标示成分的测定速率。

第二，大多数菁染料及其衍生物的荧光较强。

第三，这类染料可兼作简单、有效的偶合试剂。

第四，染料结构多变，通过取代基团的合理设置可使试剂具有不同的水溶性和核电性质，减弱干扰分子与被测物的键合能力。

第五，部分菁染料的吸收和荧光发射在近红外区，在测定过程中不会受到基质背景的干扰。

由于具备了上述优点，菁染料在生物大分子标记中的应用发展极为迅速，成为基因芯片测试用的首选荧光标记物之一。

此类染料可用于标示许多生物

物质阁，如抗体、抗原、蛋白质、肽、核苷酸生物、糖类、脂类、生物体细胞、细菌、病毒、血细胞、组织细胞、激素及淋巴细胞活素等；可跟踪测试生物分子、毒素及药剂性能；还可用于标示非生物物质，如可溶性聚合物、聚合物微粒、玻片、药剂及胶束等。

生物分析中花菁染料与核酸或蛋白的作用一直倍受科研工作者的重视，

对这一问题的广泛研究有助于深化人们对核酸或蛋白质结构以及功能的认

识。

Yarmoluk课题组【孤33】迄今就已有数十篇以“Interactionofcyaninedyes

withnucleicacids”为题的系列文章发表在各种学术期刊上。

Ogul，chansky[33】等在研究花菁与核酸的作用时发现染料聚集会对染料本

身的性质产生影响。

一些用于核酸研究的花菁染料在室温水溶液中呈现两个不同的荧光谱带：

第一个谱带是游离染料单体的发射，红移的第二个谱带是染料分子聚集体的荧光发射，并且在吸收光子后，它们分子内的电荷分布亦

发生了变化【341。

他们【33】还进一步研究了花菁染料K-6及K-T与核酸的相互作用。

吸收光谱表明：

在没有核酸存在的水溶液中，K-6和K．T均可以发生H．聚集；当核酸加入后，该聚集被打破，染料以单体形式同核酸结合，表现出

染料分子的荧光；随着染料浓度的增大，染料分子与核酸碱基对的比例增大，染料的另一种H．聚集体形成了，这种聚集源自染料对核酸结合位点的最大填充，有利于染料以聚集体形式在核酸上固定。

这种在核酸存在下形成的H．聚集体与没有核酸存在下形成的H．聚集体在结构上有明显的区别。

U等人1351利用新型水溶性近红外花菁染料DTCY与蛋白结合后吸收光谱的变化来研究其与蛋白质间的相互作用。

该方法还用于人血液及尿液中蛋白含量的测定，取得了满意的结果。

Lee等人研究发现单甲川花菁染料即噻唑橙（To）可作为非共价DNA及RNA测定的一类重要的荧光探针【鄞7】。

鉴于此，Drexhage6）l：

究]J、组138】首先基于嚼唑并【4，5-b】吡啶以及喹啉类化合物设计合成出12种新型的分别带有双电

荷、三电荷及四电荷的阳离子型单甲川花菁染料单体及同型二聚体：

随后采用改进的技术设计合成出12种分别带有单电荷、双电荷及三电荷的阳离子型含2．羟基丙基及3．氯．2．羟基丙基的单qjJII花菁染料139l；又利用同样的方法1401

设计合成了14种分别带有单电荷、双电荷及三电荷的阳离子型噻唑橙类单甲川花菁染料。

实验结果证明：

所合成的这些染料分子与DNA或RNA作用时都

有明显的荧光增强，因此都可应用于DNA分子的检测。

Panova等．）L141】考察了新型的阴离子花菁染料

（1）与蛋白之间强烈的非共价结合作用。

对细胞外蛋白及胶原质进行非共价标记后，利用其标记前后吸收光谱的变化研究了人体器官内蛋白的功能。

该方法还有望用于某些疾病的诊断。

本课题组研究成员对花菁染料在生物分析中的应用进行了大量研究，设计、合成出一系列花菁染料（2．5），并根据其光谱性质进进一步的筛选，据以建立了核酸及蛋白质的新的光谱分析方法【42491。

根据花菁与生物分子（特别是核酸及蛋白质）间的相互作用原理：

要获得灵敏的光谱响应，探针分子

应该在水溶液中具有强的聚集能力；这样，当染料与生物分子结合时，能通过解聚获得强的染料单体的荧光。

联二花菁类染料（如TOTO和YOYO）较之花菁单体具有更强的聚集倾向，因此正逐步成为核酸分析领域中一类非常重要的荧光染料。

花菁染料摩尔吸收系数大、荧光量子产率高、聚集和解聚过程的光谱变化显著，非常适合在高灵敏的光谱分析中应用；花菁染料还有一个重要特性—通过共轭链长度的调节，其吸收和发射谱带可从可见光区一直延伸到近红外区，而红区测量具有低光谱背景及基质背景干扰等特点，非常适合在生

物复杂试样的分析中进行应用。

近年来，花菁类探针的研究及应用也一直受到分析化学家们的关注。

1．13．2花菁染料用于光学分子传感的研究

分子传感器是一类可以根据待测目标物种的存在而改变自身的某些理化性质（如颜色、光学信号、电化学信号等），从而具有报告功能的分子。

大部分传感分子主要由发色团共价结合识别单元构成，识别单元通常由冠醚、穴状配体及杯芳烃等目标物种的受体构成，受体与待测目标物种的选择性结合引起发色团的光谱变化，表现出客体键合光调控的行为【艄l。

花菁染料由于其自身优良的光谱特性（如前所述），近年来常作为信号报告基团而有效地应用于光学分子传感系统的设计中。

涉及的机理主要有分子内电荷转移（ICr）、光诱导电子转移（唧）、聚集一解聚等，分别总结如下：

1．13．2．1基于分子内电荷转移（ICI．）的机理较早的将花菁染料用于光学分子传感的是Gromov研究小组155,561，他们运用电子光谱研究了含有冠醚部分的吲哚类和苯并噻唑类苯乙烯染料与碱t金属离子的结合行为及其光谱效应。

在化合物6q,，当其S03"基团协同参与冠醚对M92+的络合时，诱导花菁顺式结构（染料．FI标物复合物7）的形成，使得

花菁P电子共轭系统发生扭曲，进而显现出光谱响应。

Thomas等【57】人研究了一类含有氮杂冠醚部花菁的光物理特性及其与碱金属离子结合的光学效应。

由于存在分子内电荷转移的光物理效应，化合物8的光谱显现明显的溶剂效应：

随着溶剂极性的增大，最大吸收波长处的吸收强度减小，斯托克位移增大，荧光量子产率降低。

染料8在二氯甲烷／乙氰（95／5VⅣ）混合溶剂中最大吸收在516nm处，最大发射614nm处；与金属离子络合后，抑制了分子内电荷转移，吸收和发射谱带都发生蓝移，并且荧光量子产率增大。

Lednev等人【58l利用共振拉曼和预共振拉曼（RR）光谱研究了染料分子6、9、10以及它们在乙氰溶液中-与M92+的络合行为。

这些化合物的共振拉曼光谱显示出明显的分子内电荷转移的特征；与此同时，由于共振效率的选择性，反式结构在拉曼光谱中占主导地位。

所有这些含冠醚的花菁的RR光谱都在1271cm一．1273cmd波数处出现15．冠．5的特征共振吸收，且在乙氰溶液中伴随着M孑+的加入而呈现负位移。

作者认为这源于染料与M92+形成络合物后引起的分子内电荷的移动，从而导致碳碳单键的削弱和碳碳双键的加强。

Takeuchi等人【59】通过荧光和CD光谱研究了花菁11选择性键合单糖的行为。

染料的分子内电荷转移激发态表现为弱荧光。

在低糖浓度下糖与二硼酸花菁11形成1：

1的络合物，阻止了分子的扭曲，削弱了分子内电荷转移，染料分子刚性及平面性增强，因而随着糖浓度的增大，荧光逐渐增强，且为CD活性的。

当糖浓度进一步增大时，糖与二硼酸花菁1l形成2：

1的络合物，染料分子的刚性及平面性被打破，荧光强度又逐渐减弱，相应CD活性的比例也随之减小。

由此可以看出，在单糖浓度逐渐增大的过程中，染料分子的荧光强度经历了由低到高再到低的变化，同时CD光谱也经历了由失活到活性再到失活的变化过程。

因而，不管利用荧光光谱还是CD光谱，都可以达到传感单糖的目的。

这种连接有两个硼酸结构单元的花菁染料是一类非常有用的单糖传感器。

11Mazi色res等人【印】将两个环磷酸酯分别固定于N，N’．二羧基烷基硫羰花菁的两个羧基上，设计出新型的近红外荧光探针12，并研究了乙腈溶液中其与Ca2+禾]M92+离子的键合行为。

研究发现：

Ca2+、M92+离子的加入使探针分子的自由转动受到约束，整个分子的刚性及平面性大大增强，因此体系的荧光也随之显著增强。

此设计原理也已为飚m等人乎1】所报道。

Patonay等人【62】研究了冠醚花菁JCM．15．冠．5（13）的光物理性质及其与碱金属【j+结合的光学特性，发现化合物13由于发生从氨基到花菁端核N原子间分子内电荷转移使其ICT激发态显示出很强的荧光，而其局部激发态（LE）无荧

光产生。

带有正电荷的金属Li+与氨基N原子孤对电子间存在强的静电作用，因而体系中U+的加入抑制了分子内电荷转移，导致ICT态荧光强度显著降低：

又由于溶剂化后的U+的相对尺寸恰与冠醚15．冠．5空腔尺寸相匹配，化合物对Ij+的测定显示出很高的选择性；形成的络合物也具有很高的稳定性。

作者据此建立了一种近红外区测定Li+的新方法。

Zhu等人【63】基于氟离子对硅氧键的特异性断裂反应，合成具有“推一拉”电子Mazi色res等人【印】将两个环磷酸酯分别固定于N，N’．二羧基烷基硫羰花菁的两个羧基上，设计出新型的近红外荧光探针12，并研究了乙腈溶液中其

与Ca2+禾]M92+离子的键合行为。

研究发现：

Ca2+、M92+离子的加入使探针分子的自由转动受到约束，整个分子的刚性及平面性大大增强，因此体系的荧光也随之显著增强。

此设计原理也已为飚m等人乎1】所报道。

Patonay等人【62】研究了冠醚花菁JCM．15．冠．5（13）的光物理性质及其与碱金属【j+结合的光学特性，发现化合物13由于发生从氨基到花菁端核N原子间分子内电荷转移使其ICT激发态显示出很强的荧光，而其局部激发态（LE）无荧

光产生。

带有正电荷的金属Li+与氨基N原子孤对电子间存在强的静电作用，因而体系中U+的加入抑制了分子内电荷转移，导致ICT态荧光强度显著降低：

又由于溶剂化后的U+的相对尺寸恰与冠醚15．冠．5空腔尺寸相匹配，化合物对Li+的测定显示出很高的选择性；形成的络合物也具有很高的稳定性。

作者据此建立了一种近红外区测定Li+的新方法。

13Palomares[叫等人设计合成了苯并噻唑半花菁染料15，该化合物具备以下的构型特征：

首先，分子杂环端核带正电的N原子与对位的N原子间形成“推．拉”电子结构，利于分子内电荷转移，外界物质的引入可使其电荷转移受到影响，从而改变物质分子的吸收及荧光光谱；其次，化合物中含有S原子，为一些亲硫性离子（如H矿+）的测定提供了好的作用位点；另外，该化合物在其最大吸收波长处体现出较高的摩尔吸收系数（￡．104M。

1L'md）。

因而该化合物用-亍：

H92+的荧光法或比色法测定时体现出很高的选择性及灵敏度。

不同温度下核磁滴定表明，化合物15以平面型反式及非平面型顺式两种形式存在于同一体系中；热力学计算表明，反式形式较顺式形式稳定，且平面型的反式结构更利于分子内的电荷转移一因而在中性溶液中，整个体系呈现红色，而H92+

的加入使体系明显减色。

作者推测其对H92+识别的机理为分子中s原子和羟基与H92+络合形成稳定的1：

1络合物；与此同时，以反式形式存在的化合物15发生异构化作用而转化为顺式结构，相应地分子也由原来的平面型转化为非平面构型，进而导致吸收光谱蓝移及溶液颜色变浅。

该化合物合成方法简便，且可直接用目视法对H92+进行检测，方法简单快捷，测定灵敏度高。

1．13．2．2基于光诱导电子转移（唧’）的机理

Akkaya等人【65]将Ca2+受体一富电子的二（2．氨基苯酚）乙烷．N，N，N，，N’．四乙酸（BAPlrA）与七次甲基阳离子花菁染料相连，设计了一个PET型近红外光学分子探针16。

由于BAPTA与七次甲基阳离子花菁染料间存在强的P嘣程，因而在水溶液中探针分子16表现为弱荧光，而当BAPTA键合Ca2+

后，分子内PET过程受到抑制，体系的荧光逐渐增强，因而利用荧光增强法

达到了传感Ca2+的目的。

由于测定波长位于近红外区且BAPTA对Ca2+识别的特异性，该化合物对Ca2+的检测不仅具有高的灵敏度，还具有高的选择性。

Nagano等Ai删则合成一系列近红外花菁染料，进一步研究了氨基取代前后花菁染料光物理性质的变化，发现花菁染料的吸收及发射波长与取代基氨基上电荷密度有关：

电荷密度越小，花菁染料最大吸收波长就越长；而其最大发射波长几乎没有变化。

基于此，Nagano等人将七次甲基阳离子花菁染料

与二吡啶乙基乙二胺（DPEN）相连，设计合成出一种PET型近红外荧光探针17，并利用比率荧光法实现了对zIl2+的检测。

由于测定在近红外区，相对于其它zn2+传感器来说，该方法不仅选择性好，灵敏度也得到了大大的提高。

该研究小组还将七次甲基阳离子花菁染料与邻苯二胺相连组成一种PET型传感分子181671，在研究其光物理性质的基础上，利用邻苯二胺与NO生成苯并三氮唑的特异性反应，建立了一种近红外区测定NO的新方法。

由于探针分子具有良好的膜渗透性，该方法成功地被应用于细胞内NO的检测根据相似的原理，Tang等A[68】合成了化合物19。

19是将2，2’．二吡啶胺（DPA）与七次甲基阳离子花菁染料相连而形成的近红外染料。

在pH7．4的HEPES缓冲体系中，zIl2+可与DPA．单元螯合，使分子内光诱导电荷转移（VET）过程受到抑制，探针分子19的发射峰显著增强。

探针分子合成条件温和；且DPA与N，N，N’，N’．四（2．吡啶）7,--胺田E№结构相似，该探针分子不需要

进一步修饰即可渗入细胞膜内用于活体检测。

作者将其应用于巨噬细胞内zIl2+的检测，获得满意的结果。

尽管近红外染料用于生物细胞成像研究已有人报道1671，将近红外染料用于生物组织内金属离子的检测目前还是首例。

1．1．323基于聚集一解聚的机理

Zhang等人则巧妙地利用冠醚对金属离子的特异性识别及花菁染料聚集与解聚时吸收光谱的变化，开展金属离子的光学识别研究：

首先借助于冠醚悬挂菁染料20对钠离子的识别，实现了花菁染料由H．聚集体向J．聚集体转化【691；随后又借助于另一菁染料2l对钾离子的识别，实现花菁染料由J．聚集体向H．聚集体转化[70l。

Zhu等人则将花菁染料用作生物分子探针【421，利用其聚集体与单体间的转化来进行信号响应。

这些报道说明了花菁染料不同形式的聚集体间或聚集体与单体间可以通过对其施加外来化学刺激而相互转化。

另外，由于花菁染料特殊的结构特征和光学性质，其在荧光免疫分析171刀l、表面活性剃731、光学成像174-76]等方面也都起着非常重要的作用。

但花菁染料最大的弱点就是光学稳定性差，这也是影响其应用的一个重要因素，因此需要应用有机合成及染料化学的知识，进一步改善和设计开发新的花菁，研究其各项功能与分子结构的关系，以求其得到更为广泛的应用。

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