微生物检测方法USP.docx
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微生物检测方法USP
<61>非无菌产品微生物检查：
微生物计数检查
简介：
下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。
该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品。
若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。
一般程序
为了避免外来微生物的影响，必须在设定的条件下进行微生物检查。
为避免此污染所采取的预防措施必须不影响所要进行检查的微生物。
如果待测样品具有抗微生物活性，则在可能的情况下，移除或中和这种抗微生物活性。
如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
计数方法
用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择的方法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照
一般原则
必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。
如果在检测过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变，则必须证明其适用性。
测试菌株的准备
用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。
使用菌种培养维护技术（菌种系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。
按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行培养。
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备A.brasiliensis孢子混悬液，可加入0.05%的聚山梨酯80。
在2小时内使用该混悬液或如果在2°－8°储存则在24小时内使用。
作为一种替代的方法，可以配制并稀释植物细胞A.brasiliensis或B.subtilisde新鲜混悬液，配制一份孢子的稳定混悬液，然后用适量的此孢子混悬液进行接种。
此稳定的孢子混悬液可在2°－8°在验证过的一段时间内保存。
阴性对照
为了确认检测条件，用稀释剂代替样品溶液进行阴性对照。
阴性对照必须没有微生物生长。
在检测“产品检测”项下描述的产品时也需要进行阴性对照，阴性对照失败需进行调查。
培养基生长促进
对每一批准备好的培养基和每一批由脱水培养基或原料制成的培养基进行检测。
在大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂部分/培养皿上接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。
在沙氏葡萄糖琼脂培养皿中接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。
根据表1中的规定进行培养。
表1.检测微生物的准备和使用
生长促进
产品中计数方法的适用性
微生物
测试菌株的准备
需气菌总数
霉菌和酵母菌总数
需气菌总数
霉菌和酵母菌总数
金黄色葡萄球菌，如ATCC6538、NCIMB9518、CIP4.83、或NBRC13276
大豆酪蛋白消化琼脂或大豆酪蛋白消化肉汤
30°-35°
18-24小时
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
绿脓杆菌，如ATCC902、NCIMB8626、CIP82.118或NBRC13275
大豆酪蛋白消化琼脂或大豆酪蛋白消化肉汤
30°-35°
18-24小时
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
枯草芽孢杆菌，如ATCC6633、NCIMB8054、CIP52.62或NBRC3134
大豆酪蛋白消化琼脂或大豆酪蛋白消化肉汤
30°-35°
18-24小时
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30°-35°
≤3天
白色念珠菌，如ATCC10231、NCPF3179、IP48.72或NBRC1594
沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤
20°-25°
2-3天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30°-35°
≤5天
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20°-25°
≤5天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30°-35°
≤5天
MPN:
notapplicable
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20°-25°
≤5天
黑曲霉菌，如ATCC16404、IMI149007、IP1431.83或NBRC9455
沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂
20°-25°5-7天或直到有好的芽孢形成
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30°-35°
≤5天
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20°-25°
≤5天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30°-35°
≤5天
MPN:
notapplicable
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20°-25°
≤5天
对于固体培养基，由一个大于2的因子和由标准化接种物计算值得到的增长必须相同。
对于新制备的接种物，微生物的生长情况应该和之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较。
如果与之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较，微生物的生长情况是明显可见的，那么液体培养基亦适用。
产品中计数方法的适用性
制备样品
制备样品的方法取决于待测品的物理性质。
如果以下程序均不能达到令人满意的效果，则应开发其他替代的程序。
水溶性待测样品：
在PH7.0的氯化钠-蛋白胨溶液、PH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化肉汤中溶解或稀释（通常准备1：
10的稀释液）待测样品，将PH值调节至6-8。
如果需要进一步稀释，应使用相同的稀释剂。
不溶于水的非脂肪性样品：
在PH7.2磷酸盐缓冲液，PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白酶消化肉汤中制备待测品混悬液（通常按1：
10稀释），可加入例如1g/L的聚山梨酯这一类表面活性剂来帮助亲水性差的物质形成悬液。
如果需要调节PH到6-8。
如果需要，可用同样的稀释剂进一步稀释。
脂肪性产品：
用经过除菌过滤后的肉豆蔻酸异丙酯溶解样品，或将样品与最小需要量的无菌聚山梨酯80或其他加热后的无菌的无抑制性的表面活性剂混合，如果需要加热，温度应不超过40°，对特殊的产品，应不超过45°。
小心混合，如果需要在水浴中保持此温度。
加入足够量的用预热过的稀释剂进行1:
10稀释后的待测样品。
小心混合，直至形成乳状液。
用含有适量无菌聚山梨酯80或其他非抑制性的表面活性剂的稀释剂进行连续的十倍稀释。
气溶胶中的液体或固体：
在无菌条件下将待测样品转移至薄膜过滤器或无菌的容器中以进行进一步的取样。
使用全部或者每个容器中计算出的剂量作为样品。
透皮贴剂：
移除透皮贴剂的保护层，将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中，有粘性的一面向上，用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性表面以防其粘在一起，然后将贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中，大力振摇至少30分钟。
接种和稀释
向按上述方法制备的样品及对照中（无待测样品）加入适量的微生物混悬液以得到不大于100CFU的接种物。
接种物的体积应不大于稀释的待测样品的体积的1%。
为了证明待测样品中可接受的微生物的回收率，必须用样品的最低可能稀释因子进行检测。
如果由于抗微生物活性或者溶解性差而无法用样品的最低可能稀释因子进行检测，则必须寻求其他合适的方案。
若不能避免对样品生长的抑制，在中和、稀释或过滤后应加入等分的微生物混悬液。
中和/移除抗微生物活性
按照“接种和稀释”的规定进行稀释的样品中微生物的回收率及按照“产品中微生物的回收率”进行培养，与对照中微生物的回收率进行比较：
如果生长被抑制（由于因子大于2而降低），则变更该计数检测方法的程序以保障结果的有效性。
变更的程序可包括，例如：
（1）增加稀释剂或培养基的体积；
（2）将特定的或一般的中和剂混入稀释剂中；
（3）薄膜过滤；上述措施结合。
中和剂：
中和剂用中和样品中的抗微生物活性（见表1）。
最好在灭菌前将其加入到所使用的稀释剂或培养基中。
如果使用了中和剂，必须做一个有中和剂无样品的空白来证明中和剂的有效性及其对微生物无毒性。
表2.干扰物质的中和剂/方法
干扰物质
潜在的中和剂/方法
戊二醛、汞制剂
亚硫酸氢钠
酚醛树脂、醇类、醛、山梨酸酯
稀释剂
醛
糖胶
季铵盐化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、二双胍类
卵磷脂
季铵盐化合物（QACs）、碘、尼泊金类
聚山梨醇酯
汞制剂
硫胶质
汞制剂、卤素、醛
六代硫酸盐
EDTA
镁或钙离子
如果没有合适的中和方法，可以假设已接种微生物的分离失败是由于产品的微生物活性。
这些信息表明样品不容易被给出的微生物污染。
但是，有可能这种产品只抑制了一些在此指定的微生物，但不抑制一些不包含在测试菌株内或不具有代表性的微生物。
因此，使用与微生物生长和规定的可接受标准相兼容的最大稀释因子进行检测。
产品中微生物的回收率
对列出的每种微生物，应分别进行试验。
只对加入测试菌株的微生物进行计数。
薄膜过滤：
使用标称孔径不大于0.45µm，这种过滤器材质的选择是基于细菌保留效率不被待测样品的组分影响这样的理念。
对列出的所有微生物，使用一个薄膜过滤器。
将按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的适量样品（大约1g样品，如果测定的CFU较多的话，可减少样品数量）移入到薄膜过滤器内，立即过滤，用适量的稀释剂冲洗薄膜过滤器。
测定需气菌总数（TAMC）时，将薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂表面上。
测定霉菌及酵母菌总数（TYMC）时，将薄膜过滤器移到沙氏葡萄糖琼脂表面上。
按表1的规定进行培养，然后计数。
平皿计数法：
平皿计数法对每中培养基至少用2个培养皿进行培养，结果取其平均数。
注皿法：
用直径为9cm的皮氏培养皿，加入1ml按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品及15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，这两种培养基均在不大于45°的条件下保存。
如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。
对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。
按照表1中的规定进行培养，用每个培养基计算的平均值，计算原始接种物中的CFU数。
表面分布法：
用直径为9cm的皮氏培养皿，在45°时向每个培养基中加入15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，使其凝固。
如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。
干燥培养基，例如在层流柜中会培养器中。
对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。
将经过测量的不少于0.1ml的按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品分布在培养基表面。
按照“注皿法”的规定进行培养基计数。
最大机率法（MPN）：
最大机率法的精确性和准确度均小于薄膜过滤法和平皿计数法。
霉菌的计数结果尤为不可靠。
由于这种原因，在没有其他可靠的方法情况下，则在TAMC计数中可使用最大机率法。
如果对使用这种方法给出了合理说明，则按照以下规定进行。
按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法，对样品连续进行3次10倍稀释。
对每个等级的稀释，1g或1ml等分3份分别接种到3个盛有9-10ml大豆酪蛋白酶消化肉汤的试管中。
如果需要，可向培养基中加入像聚山梨酯80一类的表面活性剂，或如抗微生物剂一类的钝化剂。
因此，进行三个等级的稀释，共需要接种9支试管。
在30-35℃的条件下培养所有试管，不超过3天。
若由于产品的性质导致测试结果的难以辨别或不确定，则在相同的肉汤或大豆酪蛋白酶消化琼脂进行传代培养，在相同温度及相同的条件下培养1-2天，并以传代培养的结果作为检测结果。
根据表3，确定待测样品每克或每毫升中微生物最大几率值。
表3.微生物最大几率值
每组试管中所观察到的生长情况
每克或每毫升样品内的MPN
95%置信限
每支试管中样品的克或毫升数
0.1
0.01
0.001
0
0
0
＜3
0-9.4
0
0
1
3
0.1-9.5
0
1
0
3
0.1-10
0
1
1
6.1
1.2-17
0
2
0
6.2
1.2-17
0
3
0
9.4
3.5-35
1
0
0
3.6
0.2-17
1
0
1
7.2
1.2-17
1
0
2
11
4-35
1
1
0
7.4
1.3-20
1
1
1
11
4-35
1
2
0
11
4-35
1
2
1
15
5-38
1
3
0
16
5-38
2
0
0
9.2
1.5-35
2
0
1
14
4-35
2
0
2
20
5-38
2
1
0
15
4-38
2
1
1
20
5-38
2
1
2
27
9-94
2
2
0
21
5-40
2
2
1
28
9-94
2
2
2
35
9-94
2
3
0
29
9-94
2
3
1
36
9-94
3
0
0
23
5-94
3
0
1
38
9-104
3
0
2
64
16-181
3
1
0
43
9-181
3
1
1
75
17-199
3
1
2
120
30-360
3
1
3
160
30-380
3
2
0
93
18-360
3
2
1
150
30-380
3
2
2
210
30-400
3
2
3
290
90-990
3
3
0
240
40-990
3
3
1
460
90-1980
3
3
2
1100
200-4000
3
3
3
＞1100
结果和说明
当核实薄膜过滤法和平皿计数法的适用性时，样品中测试微生物的平均值通过一个大于2的因子后，应与按照“接种和稀释”项下的要求所做的对照的值一致。
当核实最大机率法的适用性时，接种物的计算值必须在对照所得结果的95%置信区间内。
如果用上述的任一方法对微生物进行检测，检测结果无法达到规定的标准，可以使用与标准最接近的方法和实验条件来检测样品。
样品的检测
样品使用量
除另有规定外，取10g或10ml待测样品。
对于气溶胶中的固体或液体，取10个单位容量。
对于透皮贴剂，取10剂。
对于下述活性物质使用的样品量会减少：
每个单位剂量（如片、粒、支）小于或等于1mg，或每克或每ml（对于某些无法用单位剂量来衡量的制剂）中药物活性物质的含量小于1mg。
在上述情况中，所使用的待测样品量应不少于10个单位剂量或取用10g或10ml样品。
对于用作活性成分的物质，如果样品量已被限制或批量很小（例如小于1000ml或1000g），测试取样量应为批量的1%，除非另有规定或给出合理的理由或是被批准可以使用更少用量的样品。
对于批量少于200个实体的样品（例如用作临床试验的产品），样品量可以减少至2个单位，如果批量少于100个实体，样品量可减少至1个单位。
对未包装的物料或已包装制剂以最小包装单位随机抽取样品。
为得到规定的取样量，混合足够数量的最小包装单元来取得样品。
样品检测
薄膜过滤
使用可以移动到培养基内的过滤器。
根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，将适量的样品分别移入两个薄膜过滤器中，立即过滤。
用的适宜的程序清洗过滤器。
测定TAMC时，将一个薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂的表面。
测定TYMC时，将另一个薄膜移到沙氏葡萄糖琼脂表面。
盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。
计算每克或每ml样品中的CFU数。
此处有一段有关透皮贴剂的检测方法没有翻译出。
平皿计数法
注皿法：
根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。
盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。
根据需要稀释的等级以及TAMC需要显示的最大菌落数为250、TYMC需要显示的最大菌落数为50等来选择培养皿。
用每个培养基的算数平均值来计算每克或每ml样品中的CFU数。
表面分布法：
根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。
按照“注皿法”项下的描述进行培养和计算CFU数。
最大机率法：
根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法。
所有试管均在30°-35°培养3-5天。
如果需要的话用适宜的程序进行传代培养。
记录每个稀释等级的试管中微生物的生长情况。
根据表3来确定每克或每ml样品中微生物的最可能数量。
结果说明
大豆酪蛋白酶消化琼脂中的CFU数就视为需气菌总数（TAMC）；若在此培养基中检测到真菌的菌落，则也视为TAMC的一部分。
沙氏葡萄糖琼脂中的CFU数就视为酵母菌/霉菌总数（TYMC）；若在此培养基中检测到细菌的菌落，则也视为TYMC的一部分。
当由于细菌的生长致使TYMC超出了可接受标准时，就需要用到含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂。
用MPN方法计算出的值为TAMC。
微生物质量可接受标准描述如下：
—101CFU：
最大可接受值=20；
—102CFU：
最大可接受值=200；
—103CFU：
最大可接受值=2000，等等。
推荐使用的溶液及培养基会在<62>控制菌的检测中列出。
<62>非无菌产品微生物检测：
控制菌的检测
简介
下述的检测方法是用来限制或确定没有按所描述的条件可检测到的控制菌存在。
这些方法最初是用来确定一种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当用作此种目的时，请按下述说明程序进行，包括需要的样品数及按照下述的要求对检测结果进行说明。
其他的微生物程序包括自动的方法，有可能会被用到，这需要证明这些方法等效于药典的方法。
一般程序
按照“<61>非无菌产品微生物检查：
微生物计数检查”所述对样品进行处理。
如果待测样品有抗菌活性，需要按照“<61>非无菌产品微生物检查：
微生物计数检查”的要求除去或中和这种抗菌活性。
如果在准备样品时使用了表面活性剂，那么就需要按照“<61>非非无菌产品微生物检查：
微生物计数检查”.的要求证明这些表面活性剂对微生物是没有毒性的，以及他们与所使用的钝化剂是可以兼容的。
培养基的生长促进和抑制特性、检测的适用性及阴性控制
必须证明使用的检测方法能够从待测样品中检测出微生物的存在。
如果检测方法有改变或引入了会影响检测结果的样品，则需要证明方法的适用性。
检测菌株的准备
使用下述的标准化的检测菌株。
使用菌种培养保养技术（菌种系统），以使用于培养的微生物从原始主菌种中移除的片段不大于5个片段，。
需氧微生物
用大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂分别培养每种检测菌株，在
30°-35°培养18-24小时。
用沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤在20°-25°单独培养白色念珠菌菌株2-3天。
金黄色葡萄球菌
例如ATCC6538、NCIBM9518、CIP4.83或NBRC13276
绿脓假单胞菌
例如ATCC9027，NCIMB8626、CIP82.118或NBRC13275
大肠埃希菌
ATCC8739，NCIMB8545、CIP53.126或NBRC3972
鼠伤寒沙门氏菌，或作为可供选择的
例如ATCC14028
Abony沙门氏菌
例如NBRC100797、NCTC6017、CIP80.39
白色念珠菌
例如ATCC10231、NCPF3179、IP48.72或NBRC1594
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2的磷酸盐缓冲液制备检测混悬液。
在2小时内使用该混悬液，如果在2-8℃贮存的话，在24小时内使用。
梭状芽孢杆菌
用产芽胞梭状芽胞杆菌，例如ATCC11437（NBRC14293，NCIMB12343，CIP100651）或ATCC19404（NCTC532或CIP79.3）或NBRC14293。
在30°-35°无氧条件下，用梭状芽胞杆菌强化培养基培养梭状芽孢杆菌检测菌株24-48小时。
作为一个可供选择的方法，准备及稀释一个新的用作接种的稳定的Cl.sporogenes植物细胞混悬液。
在验证过的周期内这个稳定的混悬液可以在2°-8°保存。
阴性对照
为了证实检测条件，用选定的稀释剂代替样品进行阴性对照，阴性对照必须无微生物生长。
在检测“样品检测”项下描述的样品时也需要进行阴性对照。
失败的阴性对照需要进行调查。
培养基的生长促进和抑制特性
测试每一批现成的培养基及每一批用脱水培养基或原料制成的培养基。
照表1的描述来验证相关培养基的特性。
表1.培养基生长促进、抑制及指示特性
表2.6.13.1—培养基生长促进、抑制及指示特性
测试/培养基
特性
测试菌株
耐胆汁的革兰氏阴性菌检测
肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔
生长促进
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
生长抑制
金黄色葡萄球菌
紫红胆盐葡萄糖琼脂
生长促进+指示
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌检测
麦康凯肉汤
生长促进
大肠埃希菌
生长抑制
金黄色葡萄球菌
麦康凯琼脂
生长促进+指示
大肠埃希菌
沙门氏菌检测
绿沙门氏菌浓缩肉汤
生长促进
鼠伤寒沙门氏菌
Abony沙门氏菌
生长抑制
金黄色葡萄球菌
戊醛糖、赖氨酸、脱氧胆酸琼脂
生长促进+指示
鼠伤寒沙门氏菌
Abony沙门氏菌
绿脓假单胞菌检测
溴棕三甲铵琼脂
生长促进
铜绿假单胞菌
生长抑制
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌检测
甘露醇盐琼脂
生长促进+指示
金黄色葡萄球菌
生长抑制
大肠埃希菌
梭状芽胞杆菌检测
梭状芽胞杆菌强化培养基
生长促进
Cl.sporogenes
哥伦比亚琼脂
生长促进
Cl.sporogenes
白色念珠菌检测
沙氏葡萄糖肉汤
生长促进
白色念珠菌
沙氏葡萄糖琼脂
生长促进+指示
白色念珠菌
液体培养基促生长特性试验
用适当的培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，在规定温度下培养，培养时间不大于规定的最短培养时间。
清晰可见的微生物的生长情况应与先前试验所观察到的结果及已批准批次的培养基得到的结果是一致的。
固体培养基促生长特性试验：
用表面分布法（<61>非无菌产品微生物检查：
微生物计数检查中的平皿计数法），每个培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，
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