血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.docx
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血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
实验一血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
一、目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。
二、原理
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳：
采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维薄膜电泳法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅12μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。
目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材
1．醋酸纤维薄膜（2×8cm）
2．常压电泳仪
3．点样器
4．培养皿
5．粗滤纸
6．玻璃板
7．竹镊
8．白磁反应板
9．新鲜血清
四、试剂
1．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）
巴比妥2.67g，巴比妥钠15.45g，加水至1000m1。
2．染色液
含氨基黑10B0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，水40m1。
可反复使用。
3．漂洗液
含甲醇或乙醇45m1，冰醋酸5ml，水50m1。
4．透明液
含无水乙醇7份，冰醋酸3份。
五、操作
1．浸泡：
用镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别光泽面与元光溶面，并在一角做上记号），放在缓冲液中浸泡20min。
2．点样：
把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后将无光泽重面朝上平铺在玻璃扳上。
将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下，再在膜一端1.5cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上细条状的血清样品。
掌握点样技术，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
3．电泳：
如图1.在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽的液面等高，将膜条无光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁）。
膜条上点样一端靠近负极。
盖严电泳室，通电，调节电压90～100V，电流强度0.4～0.7mA/cm2，通电45～60min，待电泳区带展开2.5～3cm时，关闭电源。
４．染色：
电泳完毕后，将膜条取下放在染色液中浸泡10min。
5．漂洗：
将膜条从染色液中取出后，在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。
从正极端起，依次为：
清蛋白、α1蛋白、α2球蛋白。
β蛋白、γ球蛋白。
如图2所示：
定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪下，分别浸在0.4NNaOH溶液中，并剪下相同大小的无色区带，膜条作空白对照，迸行比色；或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3min后贴于洁净玻璃板上，干后，即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。
实验二酪蛋白的制备
一、目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酶蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到纯的酪蛋白。
三、器材
1．牛奶
2．离心机
3．抽滤装置
4．精密pH试纸或酸度计
5．电炉
6．烧杯
7．温度计
四、试剂
1．95%乙醇
2．无水乙醚
3.0.2MpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液
A液：
0.2M醋酸钠溶液
B液：
0.2M醋酸溶液
称有机纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g,定容至1000ml
4.去A液1770ml,B液1230ml混匀，即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。
5.乙醇乙醚混合溶液：
乙醇:
乙醚=1:
1（V/V）
五、操作
1.将100牛奶加热到4℃。
边搅拌边缓缓加入预热至40℃的缓冲液，并调节pH之后，冷却至室温。
以3000r/min离心10min。
弃去上清液，得酪蛋白粗制品。
2.用水洗涤三次，3000r/min离心，弃去上清液。
3.在沉淀中加入乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇-乙醚混合液沉淀两次，最后再用乙醚沉淀两次，抽干。
4.将沉淀摊开在表面皿上，干燥后得酪蛋白纯品。
5.准确称量后，计算含量，并与理论含量（3.5g/100ml）相比求出实际得率。
酪蛋白含量g/100ml：
牛乳（g%）
得率=
100%
实验三甲醛滴定法测氨基氮
一、目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、原理
水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，可形成—NH—CH20H，—N（CH2－0H）2等羟甲基衍生物，使NH3+放出的H＋游离出来，这样就可用碱滴定放出的H＋，测定氨基氮，从而计算出氨基酸的含量。
若样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量。
若样品是多种氨基酸的混合物〈如蛋白水解液〉，则滴定结果不能作氨基酸滴定量的依据。
一般常用此法测定蛋由质水解程度，水解程度的增加滴定值增大，当水解完全后，滴定值保持平衡。
但脯氨酸与甲醛作用生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低；脯氨酸的酚基结构又可使滴定结果偏高。
三、器材
1、锥形瓶
2、25ml碱式滴定管
3、移液管
四、试剂
1．0.5%酚酞酒精溶液
0.5g酚酞溶于100mL60%乙醇中
2．0.05%溴麝香草酚蓝溶液
0.05g溴麝香草酚蓝溶于100mL20%乙醇溶液中
3．1％甘氨酸溶液
1g甘氨酸溶于100rnl蒸馏水
4．标准0.100mol/LNaOH溶液，可采用0.100mol/L标准HCl溶液标定
5．中性甲醛溶液
50ml甲醛溶液，加约3ml0.5%酚酞指示剂，滴加o.1mol/LNaOH溶液，使溶液成微粉红色，临用前配制。
五、操作
取3只锥形瓶，编以1、2、3号。
于1、2号瓶中各加甘氨酸溶液2.0ml及水5.0ml；
于3号瓶中加水7.0ml。
然后3只锥形瓶中各加入甲醛溶液5.0ml,0.05%溴麝香草酚蓝溶
液两滴及0.5%酚酞酒精溶液4滴。
再用标准0.1mol/LNaOH溶液，滴定至紫色（pH0.7-9.0）。
则每ml氨基酸溶液中含氨基氮的mg数为：
氨基氮（mg/ml）=
注：
A——滴定样品消耗NaOH溶液的ml数
B——滴定空白消耗NaOH溶液的ml数
1.4008——1ml0.1mol/LNaOH溶液相当的氮mg
实验四氨基酸纸层析法
一、目的
通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。
二、原理
用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。
纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。
滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。
将样品点在滤纸上（此点称原点），进行展层，样品中氨基酸在两相中不断迸行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是将氨基酸分离开来。
形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。
本实验采用纸层析法分离氨基酸。
氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
三、器材
1．氨基酸溶液：
缬氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸溶液及它们的混合液，各组分浓度均为0.5％。
2．层析缸
3．层析滤纸（新华1号）
4．毛细管
5．吹风机
6．烘箱
7．喷雾器
8．刻度尺
9．铅笔
10．表面皿
四、试剂
1．展层剂：
正丁醇：
甲酸：
水＝15：
3：
2（V／V）
2．显色剂：
0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，即得0.5％茚三酮一无水丙酮溶液，贮于棕色瓶中备用。
五、操作
1．标记：
取层析滤纸（22×14cm）一张。
在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。
2．点样：
用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，点子直径不超过3mm,边点样边用电吹风吹干。
3．展层：
将点好样滤纸放入装于展层剂的层析缸内，展层剂必须在点于下方。
盖层析缸。
待溶剂上升至15～20cm，用铅笔描出溶剂前沿界线，把滤纸放于表面皿上，于烘箱内105℃15min烘干。
4．显色：
用喷雾器均匀喷上显色剂后于烘箱内100℃5min，即可显出个层析斑点。
5．计算各种氨基酸的Rf值。
实验五酵母核糖核酸的提取及组分鉴定
一、目的
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、原理
酵母核酸中RNA含量较多，DNA少于2%。
RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，加入乙醇可使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA粗制品。
三、器材
1．干酵母粉
2．天平
3．烧杯
4．抽滤瓶
5．布氏漏斗
6．移液管
7．玻棒
8．pH试纸
9．离心机
四、试剂
1．0.2%NaOH溶液
2．乙酸（A.R）
3．95%乙醇
4．无水乙醚（C.P）
5．氨水（C.P）
6．10％H2SO4溶液
7．5％AgNO3溶液：
5gAgNO3溶于蒸馏水，定容至l00ml，贮于棕色瓶中。
8．苔黑酚一三氯化铁试剂
9．定磷试剂
五、操作
１．RNA的提取
称取４g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴中加热30min并经常搅拌。
加数滴乙酸，使提取液呈酸性。
4000r/min离心10～15min，取上清夜，边搅边搅拌边加入95%乙醇洗涤两次，无水乙醚洗两次后，将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤，干燥后即得粗RNA。
２．鉴定：
取上述粗RNA0.5g，加10%H2SO4溶液5ml，加热至沸1～2min，制得RNA水解液。
（１）嘌呤碱：
取水解液2ml，加氨水2ml，5％NaOH溶液，观察是否产生絮状嘌呤碱的银化合物。
（２）核糖：
取水解液0.５ml，加苔黑酚-FeCI3；试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化。
（３）磷酸：
取水解液1ml，加定磷试剂1ml，水浴上加热，观察溶液是否变成蓝色。
实验六蒽酮比色定糖法
一、目的
掌握蒽酮比色定糖法的原理及方法。
二、原理
蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己醛糖酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
蒽酮可与其它一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当样品中存在有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
本法是一种快速而简便的定糖方法，多用于测定糖原含量，亦可用于测定可溶性糖含量。
三、器材
l．移液管
2．刻度试管
3．水浴锅
4．冰浴锅
5．72型分光光度计
四、试剂
1．无蛋白糖类溶液：
2．蒽酮试剂
2g蒽酮溶于1000ml80%（v/v）硫酸中，现配现用。
3．标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）
100mg糖原溶于蒸馏水定容至1000ml。
五、操作
1．制作标准曲线
取6支试管编号，依次加入标准糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，均用蒸馏水补足至l.0ml。
置水浴中5min，各加蒽酮试剂4ml，沸水浴中准确煮沸10min，自来水冷却，室温放置10min后，比色测定光密度OD620，并以此为纵坐标，糖含量为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品含量测定
吸取1ml无蛋白糖类溶液于试管中，水浴冷却，加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，自来水冷却，静置10min后比色测OD620，并由标准曲线上查出样品液糖含量。
3．计算：
实验七酶的特性
一、目的
加深对酶性质的认识。
二、内容
（－）温度对酶活力的影响
1．原理：
酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最快。
大多数动物酶的最适温度为37～40℃，植物酶的最适温度为50～60℃。
酶对温度的稳定性与酶的存在形式有关。
有的酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显改变，但在100℃溶液中却很快宪全失活。
低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
2．器材
〈1〉试管及试管架
〈2〉恒温水浴
〈3〉冰浴
〈4〉沸水浴
3．试剂
〈1〉0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液：
现配现用
〈2〉稀释200倍的唾液
用蒸馏水漱口，以清涂食物残渣，再含一口蒸馏水，半分种后使其流入量筒并稀释200倍，混匀备用。
〈3〉碘化钾-碘溶液
20g碘化钾和10g碘溶于100ml水中，用前稀释10倍。
4．操作方法
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精遇碘不呈颜色,麦芽糖遇碘也不呈颜色。
在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管编号，分别加入1ml淀粉溶液，1、2号管中各加入稀释唾液1ml，3号管中为煮沸过的唾液1ml摇匀。
将1、3号两试管放入37℃恒温水浴，2号管放入冰水中，10min后取出，将2号管内液体分为两份，用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，记录并解释所得结果。
将2号管剩余的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，用碘液检验，记录结果。
（二）pH对酶活性的影响
1．原理
酶的活力受环境pH的影响极为显著。
不同酶的最适pH值不同。
如唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
但酶的最适pH受底物和缓冲液性质的影响。
2．器材
〈1〉试管及试管架
〈2〉移液管
〈3）滴管
〈4〉锥形瓶
〈5〉恒温水浴
3．试剂
〈1〉新配制的溶于0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液
〈2〉稀释200倍的新鲜唾液
〈3〉溶液
〈4〉柠檬酸溶液
〈5〉碘化钾-碘溶液
〈6〉pH试纸
pH分别为5.0、5.8、6.8、8.0四种
4．操作
锥形瓶号码
0.2mol/LNa2HPO4
（ml）
0.1mol/L柠檬酸
（ml）
pH
1
5.15
4.85
5.0
2
6.05
3.95
5.8
3
7.72
2.28
6.8
4
9.72
0.28
8.0
取4个锥形瓶编号，按表吸取试剂，配成pH5.0~8.0的四种缓冲溶液。
从四个锥形瓶中各取缓冲液3ml，分别注入4支编号拭管，随后每管加入0.5%淀粉溶液2ml和稀释200倍的唾液2ml，向各试管加人稀释唾液时间间隔为1min，将各试管内容物混匀，并依次置于37℃。
水浴中保温。
第4管加入唾液2min后，每隔1min从第3管中取出1滴混合液，置于白瓷板上，加一小滴碘化钾-碘溶液检验淀粉水解的程度。
待混合液变成棕黄色时，向所有试管依次添加1~2滴碘化钾-碘溶液。
添加溶液的时间间隔，从第一管起也为1min。
观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
（三）唾液淀粉酶的激活和抑制
1.原理：
酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的物质称酶的激活剂，使酶活性降低的物质称酶的抑制剂，如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，铜离子是其抑制剂。
2.器材：
〈1〉恒温水浴
〈2〉试管及试管架
3.试剂
〈1〉0.1%淀粉溶液
〈2〉稀释200倍新鲜唾液
〈3〉l％NaCl溶液
〈4〉l％CuSO4溶液
〈5〉l％Na2SO4溶液
〈6〉碘化钾-碘溶液
4.操作
取4支试管编号，分别加入0.1％淀粉溶液l.5ml和稀释唾液0.5ml后，第1管加1％CuSO4溶液0.5ml，第2管加1％NaCl溶液0.5ml，第3管加1％Na2SO4溶液0.5ml，第4管加热蒸馏水0.5ml，摇匀，置于37℃水浴保温10min后，分别加人2~3滴碘化钾-碘溶液。
记录结果并解释之，说明第3管的意义。
（四）酶的专一性
1.原理
酶具有高度的专一性。
本试验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解，而蔗糖酶催化蔗糖产生还原性葡萄糖和果搪，但不能催化淀粉的水解。
用Benedict试剂检验糖的还原性。
2.器材：
〈1〉恒温水浴
〈2〉沸水浴
〈3〉试管及试管架
3.试剂：
〈1〉2%蔗糖溶液
〈2〉稀释200倍的新鲜唾液
〈3〉新配制溶于0.3％NaCl的1%淀粉溶液
〈4〉蔗糖酶溶液
将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2~3次（离心法）后，3置于滤纸上自然干燥。
取干酵母100g放于研钵中，加适量蒸馏水和少量细沙，用力研磨，提取约1h,再加蒸馏水使总体积达原体积10倍，离心，上清夜保存于冰箱备用。
〈5〉Benedict试剂
无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml。
取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml，再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入。
本试剂可长期保存。
4.操作：
〈1〉淀粉酶的专一性
管号
1
2
3
4
5
6
0.1%淀粉溶液
（ml）
1
/
1
/
1
/
2%蔗糖溶液
（ml）
/
1
1
/
1
/
稀释唾液
（ml）
/
/
1
1
/
1
煮沸过的稀释唾唾液（ml）
/
/
/
/
1
1
蒸馏水（ml）
1
1
/
/
/
/
取6支试管编号，按上表加入试剂后，置于37℃水浴15min，各加人Benedict试剂1ml，沸水浴中2~3min后，观察现象并解释之。
〈2）蔗糖酶的专一性
取6支试管编号，测定方法与测定淀粉酶专一性基本相同，只是将所加试剂改为蔗糖酶溶液，煮沸过的稀释唾液改为煮沸过的蔗糖酶溶液，在37℃水浴中时间为15min减少为5min，其余均相同，记录结果并解释之。
实验八维生素C的定量测定
一、目的
1．学习定量测定维生素的原理和方法。
2．进一步掌握滴定法的基本操作技术。
二、原理
维生素C是人营养中最重要的维生素之一，缺乏会引起坏血病，因此又称为抗坏血酸。
维生素C为水溶性维生素，具有很强的还原性。
在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏。
在中性或酸性环境中，能将染料2，6-二氯靛酚还原成无色的还原型2，6-二氯靛酚，同时抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸。
2，6-二氯靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色，因此可在酸性条件下用其滴定样品还原型抗坏血酸，溶液A无色转变为微红时即为滴定终点。
根据染料的滴定可折算出样品中抗坏血酸的含量。
三、器材
l．松针、新鲜蔬菜和新鲜水果
2．台式天平
3．移液管
4．研钵
5．漏斗
6．锥形瓶
7．容量瓶
8．微量滴定管
四、试剂
1．2%草酸溶液
2g草酸溶于100ml蒸馏水。
2．1%草酸溶液
lg草酸溶于l00ml蒸馏水。
3．标准抗坏血酸溶液
准确称取50.0mg纯抗坏血酸溶于1%草酸溶液并稀释至500ml。
贮于棕色瓶，冷藏，最好现用现配。
4．1%HCl溶液
5．0.1%的2，6－二氯靛酚溶液
溶500mg2，6－二氯靛酚于300ml含有104mgNaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶内冷藏（4℃下约可保存1周）。
临用时以标准抗坏血酸溶液标定。
五、操作
1．制备样品液
〈1〉松针：
水洗净，滤纸吸去表面水分。
称0.5g于研钵中，1%HCl溶液5ml一起研磨，.放置片刻后，提取液移入5ml容量瓶，残渣再加1%HCl溶液5ml研磨，如此反复2～3次，最后用1%HCl溶液稀释至刻度，静置10min后过滤，滤液备用。
〈2〉新鲜蔬菜和和水果
水洗净，用纱布或吸水纸吸干水分，称取20g置于组织搅碎机中，加2%草酸溶液100ml打成浆状。
称取浆状物5.0g于容量瓶中，加2％草酸定容至50ml，静置10min后过滤，滤液备用。
2．滴定：
〈1〉滴定T值：
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于锥形瓶中加9ml草酸，以0.1%2，6－二氯靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒钟为终点，有所用染料体积计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸，即得T值。
〈2〉样品测定
准确吸取样品液两份于锥形瓶中，每份10.0rnl，滴定方法同前。
记录滴定所耗2，6一二氯靛酚溶液ml数（v），并按下式计算样品抗坏血酸含量。
抗坏血酸（mg/100g）
式中W-------10ml样液相当于含样品之g数
实验九脂肪骏的β－氧化
一、目的
了解脂肪酸β－氧化作用及滴定方法。
二、原理
在肝脏中，脂肪酸经β－氧化作用生成乙酰辅酶。
两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酸。
乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β－羟丁酸、乙酰乙酸、β－羟丁酸和丙酮总称为酮体，其为机体代谢的中间产物，正常情况下，含量甚微。
本实验用新鲜肌糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。
剩余的碘，可用标准的硫代硫酸钠滴定。
反应式为：
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
三、器材
1．家兔
2．恒温水浴
3．移液管
４．剪刀和镊子
5．锥形瓶
6．漏斗
7．试管及试管架
8．微量滴定管
9．研钵
四、试剂
1．0.1％淀粉溶液
2．0.9％HaOH溶液
3．0.5N/L丁酸溶液
吸取5ml丁酸于100ml0.5N/LNaOH溶液中，混匀。
4．15％三氨乙酸溶液
5．10％NaOH溶液
6．1o％HCl溶液
7．正丁酸
8．0.1N/L碘溶液
称12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中，定容至1000ml，混匀后，用标准0.lN／LNa2S2O3溶液标定。
9．标准0.02N／LNa2S2O3溶液
临用时将已标定的1N／LNa2S2O3稀释即可。
五、操作
1．制备肝糜：
家兔颈部放血处死，取出肝脏。
用0.9％NaCl溶液洗去污血，滤纸吸去表面水分。
称取5g置研钵中，加少量0.9％NaCl溶液，研磨成细浆。
再加0.9％NaCl溶液至总体积10m1。
2．酮体的生成：
取2个锥形瓶，各加3ml1/15mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。
向一个锥形瓶中加人2ml正丁酸；另一个锥形瓶不加正丁酸，作为对照。
然后各加入2ml肝糜，混匀置43℃恒温水浴保温⒈5小时。
3．沉淀蛋白质：
从水浴中取出锥形瓶，各加3ml15％三氯乙酸溶液，在对照瓶中追加2ml正丁聆酸，混匀，净置15min后过滤，滤液分别收集在两支试管中。
4．酮体的测定：
吸取两种滤液各2ml分别放入另外两个锥形瓶中，再备加3ml0.1N/L碘溶液和3ml10％NaOH
溶液，摇匀后静置10min。
加人3ml10％HCL溶液中和。
然后用0.02N/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余碘。
滴定浅黄色时，加入3滴淀粉溶液作指示刑。
摇匀，继续滴到蓝色消失。
记录滴定样品与对照所用的Na2S2O3溶液的ml数，并按下式计算丙酮的含量：
实验十自主设计实验
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