血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.docx

1、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳：采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维薄膜电泳法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅12m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材1醋酸纤维薄膜（28cm）2常压电泳仪3点样器4培养皿5粗滤纸6

2、玻璃板7竹镊8白磁反应板9新鲜血清四、试剂1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）巴比妥2.67g，巴比妥钠15.45g，加水至1000m1。2染色液含氨基黑10B 0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，水40m1。 可反复使用。3漂洗液含甲醇或乙醇45 m1，冰醋酸5ml，水50m1。4透明液含无水乙醇7份，冰醋酸3份。五、操作1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别光泽面与元光溶面，并在一角做上记号），放在缓冲液中浸泡20min。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后将无光泽重面朝上平铺在玻璃扳上。将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下，再在膜一端1.

3、5cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上细条状的血清样品。掌握点样技术，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。3电泳：如图1.在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽的液面等高，将膜条无光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁）。膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压90100V，电流强度0.40.7mA/cm2，通电4560min，待电泳区带展开2.53cm时，关闭电源。染色：电泳完毕后，将膜条取下放在染色液中浸泡10min。5漂洗：将膜条从染色液中取出后，在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。从

4、正极端起，依次为：清蛋白、1蛋白、2球蛋白。蛋白、球蛋白。如图2所示：定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪下，分别浸在0.4N NaOH溶液中，并剪下相同大小的无色区带，膜条作空白对照，迸行比色；或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23min后贴于洁净玻璃板上，干后，即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。实验二 酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。二、原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酶蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后

5、，便可得到纯的酪蛋白。三、器材1牛奶2离心机3抽滤装置4精密pH试纸或酸度计5电炉6烧杯7温度计四、试剂195%乙醇2无水乙醚3. 0.2MpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液A液：0.2M醋酸钠溶液B液：0.2M醋酸溶液称有机纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g,定容至1000ml4.去A液1770ml,B液1230ml混匀，即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。5.乙醇乙醚混合溶液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）五、操作1.将100牛奶加热到4。边搅拌边缓缓加入预热至40的缓冲液，并调节pH之后，冷却至室温。以3000r/min离心10min。弃去上清液，得酪蛋白粗制品。2.用水洗涤三次，3000r/

6、min离心，弃去上清液。3.在沉淀中加入乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液沉淀两次，最后再用乙醚沉淀两次，抽干。4.将沉淀摊开在表面皿上，干燥后得酪蛋白纯品。5.准确称量后，计算含量，并与理论含量（3.5g/100ml）相比求出实际得率。酪蛋白含量g/100ml：牛乳(g%) 得率=100%实验三 甲醛滴定法测氨基氮一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、原理水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，可形成NHCH20H，N(CH20H)2等羟甲基衍生物，使NH3+放出的H游离出来，这

7、样就可用碱滴定放出的H，测定氨基氮，从而计算出氨基酸的含量。若样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量。若样品是多种氨基酸的混合物如蛋白水解液，则滴定结果不能作氨基酸滴定量的依据。一般常用此法测定蛋由质水解程度，水解程度的增加滴定值增大，当水解完全后，滴定值保持平衡。但脯氨酸与甲醛作用生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低；脯氨酸的酚基结构又可使滴定结果偏高。三、器材1、锥形瓶2、25 ml碱式滴定管3、移液管四、试剂10.5%酚酞酒精溶液0.5g酚酞溶于100mL60%乙醇中20.05%溴麝香草酚蓝溶液0.05g溴麝香草酚蓝溶于100mL20%乙醇溶液中31甘氨酸溶液1g甘氨

8、酸溶于100rnl蒸馏水4标准0.100mol/LNaOH溶液，可采用0.100mol/L标准HCl溶液标定5中性甲醛溶液50ml甲醛溶液，加约3ml0.5%酚酞指示剂，滴加o.1mol/LNaOH溶液，使溶液成微粉红色，临用前配制。五、操作取3只锥形瓶，编以1、2、3号。于1、2号瓶中各加甘氨酸溶液2.0ml及水5.0ml；于3号瓶中加水7.0ml。然后3只锥形瓶中各加入甲醛溶液5.0ml,0.05%溴麝香草酚蓝溶液两滴及0.5%酚酞酒精溶液4滴。再用标准0.1mol/LNaOH溶液，滴定至紫色(pH0.7-9.0)。则每ml氨基酸溶液中含氨基氮的mg数为：氨基氮（mg/ml）=注：A滴定样

9、品消耗NaOH溶液的ml数B滴定空白消耗NaOH溶液的ml数1.40081ml0.1mol/LNaOH溶液相当的氮mg实验四 氨基酸纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。二、原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。将样品点在滤纸上（此点称原点），进行展层，样品中氨基酸在两相中不断迸行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是将氨基酸分离开来。形成距原

10、点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。三、器材1氨基酸溶液：缬氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸溶液及它们的混合液，各组分浓度均为0.5。2层析缸3层析滤纸（新华1号）4毛细管5吹风机6烘箱7喷雾器8刻度尺9铅笔10表面皿四、试剂1展层剂：正丁醇：甲酸：水15：3：2（VV）2显色剂：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，即得0.5茚三酮一无水丙酮溶液，贮于棕色瓶中备用。

11、五、操作1标记：取层析滤纸（2214cm）一张。在纸的一端距边缘23cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。2点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量1020l，点子直径不超过3mm,边点样边用电吹风吹干。3展层：将点好样滤纸放入装于展层剂的层析缸内，展层剂必须在点于下方。盖层析缸。待溶剂上升至1520cm，用铅笔描出溶剂前沿界线，把滤纸放于表面皿上，于烘箱内10515min烘干。4显色：用喷雾器均匀喷上显色剂后于烘箱内1005min，即可显出个层析斑点。5计算各种氨基酸的Rf值。实验五 酵母核糖核酸的提取及组分鉴定一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的

12、方法。二、原理酵母核酸中RNA含量较多，DNA少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，加入乙醇可使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA粗制品。三、器材1干酵母粉2天平3烧杯4抽滤瓶5布氏漏斗6移液管7玻棒8pH试纸9离心机四、试剂10.2%NaOH溶液2乙酸（A.R）395%乙醇4无水乙醚（C.P）5氨水（C.P）610H2SO4溶液75AgNO3溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水，定容至l00ml，贮于棕色瓶中。8苔黑酚一三氯化铁试剂9定磷试剂五、操作RNA的提取称取g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴中加热30min并经常搅拌。加数滴乙酸，使提取液呈酸

13、性。4000r/min离心1015min ，取上清夜，边搅边搅拌边加入95%乙醇洗涤两次，无水乙醚洗两次后，将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤，干燥后即得粗RNA。鉴定：取上述粗RNA0.5g，加10%H2SO4溶液5ml，加热至沸12min，制得RNA水解液。（）嘌呤碱：取水解液2ml，加氨水2ml，5NaOH溶液，观察是否产生絮状嘌呤碱的银化合物。（）核糖：取水解液0.ml，加苔黑酚-FeCI3；试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化。（）磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml，水浴上加热，观察溶液是否变成蓝色。实验六 蒽酮比色定糖法一、目的掌握蒽酮比色定糖法的原理及方法。二、原理蒽酮可以和游

14、离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己醛糖酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。蒽酮可与其它一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存在有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。本法是一种快速而简便的定糖方法，多用于测定糖原含量，亦可用于测定可溶性糖含量。三、器材l移液管2刻度试管3水浴锅4冰浴锅572型分光光度计四、试剂1无蛋白糖类溶液：2蒽酮试剂2g蒽酮溶于1000ml80%(v/v)硫酸中，现配现用。3标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）100mg糖原溶于蒸馏水定容至1000ml。五、操作1制作标准曲线取6支试管编号，依次加入标准糖溶液0、0.1、0.2、0.3、

15、0.4、0.5ml，均用蒸馏水补足至l.0ml。置水浴中5min，各加蒽酮试剂4ml，沸水浴中准确煮沸10min，自来水冷却，室温放置10min后，比色测定光密度OD620，并以此为纵坐标，糖含量为横坐标，绘制标准曲线。2样品含量测定吸取1ml无蛋白糖类溶液于试管中，水浴冷却，加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，自来水冷却，静置10min后比色测OD620，并由标准曲线上查出样品液糖含量。3计算：实验七 酶的特性一、目的加深对酶性质的认识。二、内容（）温度对酶活力的影响1原理：酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最快。大多数动物酶的最适温度为3740，植物酶的最适温度为

16、5060。酶对温度的稳定性与酶的存在形式有关。有的酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性并无明显改变，但在100溶液中却很快宪全失活。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2器材1试管及试管架2恒温水浴3冰浴4沸水浴3试剂10.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液：现配现用2稀释200倍的唾液用蒸馏水漱口，以清涂食物残渣，再含一口蒸馏水，半分种后使其流入量筒并稀释200倍，混匀备用。3碘化钾-碘溶液20g碘化钾和10g碘溶于100ml水中，用前稀释10倍。4操作方法淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色,麦芽糖遇碘也不呈颜色。在不同

17、温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管编号，分别加入1ml淀粉溶液，1、2号管中各加入稀释唾液1ml，3号管中为煮沸过的唾液1ml摇匀。将1、3号两试管放入37恒温水浴，2号管放入冰水中，10min后取出，将2号管内液体分为两份，用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，记录并解释所得结果。将2号管剩余的一半溶液放入37 水浴中继续保温10min后，用碘液检验，记录结果。（二）pH对酶活性的影响 1原理酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。如唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。但酶的最适pH受底物和缓冲液性质的影

18、响。2器材1试管及试管架2移液管3）滴管4锥形瓶5恒温水浴3试剂1新配制的溶于0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2稀释200倍的新鲜唾液3溶液4柠檬酸溶液5碘化钾-碘溶液6pH试纸pH分别为5.0、5.8、6.8、8.0四种4操作锥形瓶号码0.2mol/LNa2HPO4(ml)0.1mol/L 柠檬酸 (ml)pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0取4个锥形瓶编号，按表吸取试剂，配成pH5.08.0的四种缓冲溶液。从四个锥形瓶中各取缓冲液3ml，分别注入4支编号拭管，随后每管加入0.5%淀粉溶液2ml和稀释200倍的唾液2ml，向各

19、试管加人稀释唾液时间间隔为1min，将各试管内容物混匀，并依次置于37。水浴中保温。第4管加入唾液2min后，每隔1min从第3管中取出1滴混合液，置于白瓷板上，加一小滴碘化钾-碘溶液检验淀粉水解的程度。待混合液变成棕黄色时，向所有试管依次添加12滴碘化钾-碘溶液。添加溶液的时间间隔，从第一管起也为1min。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。（三）唾液淀粉酶的激活和抑制1.原理：酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的物质称酶的激活剂，使酶活性降低的物质称酶的抑制剂，如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，铜离子是其抑制剂。2.器材：1恒温水浴2试管及试管架3.试剂10.1%

20、淀粉溶液2稀释200倍新鲜唾液3lNaCl溶液4lCuSO4溶液5lNa2SO4溶液6碘化钾-碘溶液4.操作取4支试管编号，分别加入0.1淀粉溶液l.5ml和稀释唾液0.5ml后，第1管加1CuSO4溶液0.5ml，第2管加1NaCl溶液0.5ml，第3管加1Na2SO4溶液0.5ml，第4管加热蒸馏水0.5ml，摇匀，置于37水浴保温10min后，分别加人23滴碘化钾-碘溶液。记录结果并解释之，说明第3管的意义。（四）酶的专一性1.原理酶具有高度的专一性。本试验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化

21、蔗糖的水解，而蔗糖酶催化蔗糖产生还原性葡萄糖和果搪，但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检验糖的还原性。2.器材：1恒温水浴2沸水浴3试管及试管架3.试剂：12%蔗糖溶液2稀释200倍的新鲜唾液3新配制溶于0.3NaCl的1%淀粉溶液4蔗糖酶溶液将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤23次（离心法）后，3置于滤纸上自然干燥。取干酵母100g放于研钵中，加适量蒸馏水和少量细沙，用力研磨，提取约1h,再加蒸馏水使总体积达原体积10倍，离心，上清夜保存于冰箱备用。5Benedict试剂无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热

22、，溶解后冷却并加水至850ml，再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入。本试剂可长期保存。4.操作：1淀粉酶的专一性管号1234560.1%淀粉溶液（ml）1/1/1/2%蔗糖溶液（ml）/11/1/稀释唾液(ml)/11/1煮沸过的稀释唾唾液(ml)/11蒸馏水(ml)11/取6支试管编号，按上表加入试剂后，置于37水浴15min，各加人Benedict试剂1ml，沸水浴中23min后，观察现象并解释之。2）蔗糖酶的专一性取6支试管编号，测定方法与测定淀粉酶专一性基本相同，只是将所加试剂改为蔗糖酶溶液，煮沸过的稀释唾液改为煮沸过的蔗糖酶溶液，在37水浴中时间为15min减少为5min，其余均相同

23、，记录结果并解释之。实验八 维生素C的定量测定一、目的1学习定量测定维生素的原理和方法。2进一步掌握滴定法的基本操作技术。二、原理维生素C是人营养中最重要的维生素之一，缺乏会引起坏血病，因此又称为抗坏血酸。维生素C为水溶性维生素，具有很强的还原性。在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏。在中性或酸性环境中，能将染料2，6-二氯靛酚还原成无色的还原型2，6-二氯靛酚，同时抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸。2，6-二氯靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色，因此可在酸性条件下用其滴定样品还原型抗坏血酸，溶液A无色转变为微红时即为滴定终点。根据染料的滴定可折算出样品中抗坏血酸

24、的含量。 三、器材l松针、新鲜蔬菜和新鲜水果2台式天平3移液管4研钵5漏斗6锥形瓶7容量瓶8微量滴定管四、试剂12%草酸溶液2g草酸溶于100ml蒸馏水。21%草酸溶液lg草酸溶于l00ml蒸馏水。3标准抗坏血酸溶液准确称取50.0mg纯抗坏血酸溶于1%草酸溶液并稀释至500ml。贮于棕色瓶，冷藏，最好现用现配。41%HCl溶液50.1%的2，6二氯靛酚溶液溶500mg2，6二氯靛酚于300ml含有104mgNaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶内冷藏（4下约可保存1周）。临用时以标准抗坏血酸溶液标定。五、操作1制备样品液1松针：水洗净，滤纸吸去表面水分。称0

25、.5g于研钵中，1%HCl溶液5ml一起研磨，.放置片刻后，提取液移入5ml容量瓶，残渣再加1%HCl溶液5ml研磨，如此反复23次，最后用1%HCl溶液稀释至刻度，静置10min后过滤，滤液备用。2新鲜蔬菜和和水果水洗净，用纱布或吸水纸吸干水分，称取20g置于组织搅碎机中，加2%草酸溶液100ml打成浆状。称取浆状物5.0g于容量瓶中，加2草酸定容至50ml，静置10min后过滤，滤液备用。2滴定：1滴定T值：准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于锥形瓶中加9ml草酸，以0.1%2，6二氯靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒钟为终点，有所用染料体积计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸，即得T值

26、。2样品测定准确吸取样品液两份于锥形瓶中，每份10.0rnl，滴定方法同前。记录滴定所耗2，6一二氯靛酚溶液ml数（v），并按下式计算样品抗坏血酸含量。抗坏血酸（mg/100g）式中W-10ml样液相当于含样品之g数实验九 脂肪骏的氧化一、目的了解脂肪酸氧化作用及滴定方法。二、原理在肝脏中，脂肪酸经氧化作用生成乙酰辅酶。两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成羟丁酸、乙酰乙酸、羟丁酸和丙酮总称为酮体，其为机体代谢的中间产物，正常情况下，含量甚微。本实验用新鲜肌糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。剩余的碘，可用标准的硫代硫酸钠滴定。反应式为： 根据滴

27、定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、器材1家兔2恒温水浴3移液管剪刀和镊子5锥形瓶6漏斗7试管及试管架8微量滴定管9研钵四、试剂10.1淀粉溶液20.9HaOH溶液30.5N/L丁酸溶液吸取5ml丁酸于100ml 0.5N/LNaOH溶液中，混匀。415三氨乙酸溶液510NaOH溶液61oHCl溶液7正丁酸80.1N/L碘溶液称12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中，定容至1000ml，混匀后，用标准0.lNLNa2S2O3溶液标定。9标准0.02NLNa2S2O3溶液临用时将已标定的1NLNa2S2O3稀释即可。五、操作1制备肝糜：家兔颈部放血处

28、死，取出肝脏。用0.9NaCl溶液洗去污血，滤纸吸去表面水分。称取5g置研钵中，加少量0.9NaCl溶液，研磨成细浆。再加0.9NaCl溶液至总体积10m1。2酮体的生成：取2个锥形瓶，各加3ml 1/15mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。向一个锥形瓶中加人2ml正丁酸；另一个锥形瓶不加正丁酸，作为对照。然后各加入2ml肝糜，混匀置43恒温水浴保温5小时。3沉淀蛋白质：从水浴中取出锥形瓶，各加3ml15三氯乙酸溶液，在对照瓶中追加2ml正丁聆酸，混匀，净置15min后过滤，滤液分别收集在两支试管中。4酮体的测定：吸取两种滤液各2ml分别放入另外两个锥形瓶中，再备加3ml0.1N/L碘溶液和3ml10NaOH溶液，摇匀后静置10min。加人3ml10HCL溶液中和。然后用0.02N/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余碘。滴定浅黄色时，加入3滴淀粉溶液作指示刑。摇匀，继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的Na2S2O3溶液的ml数，并按下式计算丙酮的含量：实验十 自主设计实验