草果试验相关方法.docx
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草果试验相关方法
A.草果花部综合征与开花物候
花粉在柱头萌发的荧光镜观察
一．目的及意义
在盛花期，选取开花后不同天数花朵，FAA固定。
通过荧光镜观察，初步掌握荧光显微镜的使用方法及了解花粉在柱头上萌发的状况。
二．原理和方法
在草果柱头萌发的花粉，可用苯胺蓝试剂染色，造成与柱头或花柱组织染色上的分化而明显区别。
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光3650入或紫蓝光4200入）作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，可对草果花粉的荧光现象进行观察和拍照。
三．材料及药品
材料：
盛花期内，开花不同时期的花朵
药品：
FAA,6mol/LNaOH,蒸馏水，0.05%苯胺蓝（pH9-10磷酸缓冲液）
四．实验步棸
1.采集在盛花期，选取开花后不同天数花朵，置于离心管内FAA固定，带回实验室（FAA的配制：
福尔马林（38％甲醛）5ml＋冰乙酸5ml＋70％酒精90ml）。
2.用6mol/LNaOH软化花朵柱头12h.
3.蒸馏水水洗经软化后的材料。
4.0.05%苯胺蓝浸泡软化后的材料5-6h（0.05%苯胺蓝染液的配制：
苯胺蓝1g，溶于35％或95％酒精100ml）。
5.荧光镜下观察花粉是否萌发及其在柱头萌发的状况，可观察到明亮的黄绿色荧光现象，并拍照记录。
五．注意事项：
1.严格遵从实验步棸，注意各阶段处理时间。
2.制片是注意一定要保持载玻片和盖玻片的清洁，要维持花粉组织原状，决不可将组织弄碎。
3.片治好后应避光保存，而且要尽快观察，防止荧光的衰减。
4.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
5．进人暗室后接通高压稳压器电源，后再开启激发高压汞灯，当看到高压汞灯完全亮后，停止激发，再开始观察标本。
6.要注意清洁目镜及物镜镜头，观察前玻片上不能有水。
7.荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检查，节省时间；汞灯应避免多次开启，关闭高压汞灯后半小时内绝对不能重新开启。
8.每次使用后要正确关闭程序及切断电源，并在记录本上进行登记。
实验材料及场地的选择：
选择种植5或6年以上，生长发育正常的健壮植株，为便于作对照试验，可根据实验条件，实地考察后灵活选择沟边，阴坡，阳坡，及不同海拔的场地。
OOU,OND两种草果类型的区别方法：
于早上6:
00上山，可看到一种草果开始散粉，到8:
30左右已基本散尽；而另一种类型早上无变化，13:
00开始散粉，16:
30左右基本散尽。
故，显而易见，前者为OOU（上午散粉型），后者为OND（下午散粉型）。
注：
不同天气对开始散粉时间和持续时间有显著影响，阴雨天会有所延迟。
开花物候和花期
方法：
标记两种材料各30株，之后可观察记录总花期，花序花期，单花花期，并可用相机拍摄单花开花进程。
在作总花期观察时，主要记录始花期、盛花期和末花期；对于花序花期观察，则观察记录草果花序开花天数，记录总天数（果实个数/总开花数=结实率）。
每2d对总花数、开花数进行一次统计，并计算其开花百分比（开花数/总花数=开花百分比）；单花花期观察：
单花开花天数、最先开花和最后开花的时间间隔等进行详细的记录。
花的形态特征
材料：
花蕾期标记花期相近的健壮植株的花序20个，花20朵，游标卡尺。
方法：
于花蕾期标记花期相近的健壮植株的花序20个，花20朵，每天观察一次花蕾，直至花朵开放。
花开放当天，每隔2h观察一次。
观察单花进程，测量柱头上举的角度及时间（此处操作极为困难，可不做）。
从早6-7点开始，到下午花谢为止。
尤其注意早6-7点及下午3-4点区段，此量区段应连续观察。
花朵开放之后，每天观察一次，记录花朵形状、颜色、柱头状态变化情况等。
每个类型选取10株，每株摘取3朵开放的花进行观察、测量、记录花瓣和萼片的长度、颜色、大小，雄蕊和雌蕊各部分长度、颜色、形状等。
摘取不同时期的花照相，对不同时期的花序进行照相.
B.草果繁育系统
杂交指数的估算
材料：
草果植株10株，游标卡尺
方法：
按照Dafni（1992）的标准，在观测点选取个体10株，每株2朵花，进行花朵的直径及开花行为的测量评判。
具体方法是：
①花朵直径<1mm记为0，1～2mm记为1，2~6mm记为2，>6mm记为3。
②花药开裂时间与柱头可授粉期之间的时间间隔同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1。
③柱头与花药的空间位置同一高度记为0，空间分离记为1。
三者之和为OCI值。
评判标准为：
OCI=0时，繁育系统为闭花受精型；OCI=1时，繁育系统为专性自交型；OCI=2时，繁育系统为兼性自交型，有一定一交可能；OCI=3时，繁育系统为兼性异交型，部分种需要传粉者；OCI=4时，繁育系统为异交型，部分自交亲和，多数种需要传粉者。
花粉—胚珠比的估算
材料及试剂：
草果花朵每类各20朵，FAA固定液（配制方法同上）,离心管，1.0mol/LHCl，水浴锅，移液枪，显微镜，解剖针。
方法：
在观测地点，随机采取花药尚未开裂的花朵，每种类型20朵，用FAA固定液固定（以下内容回学校后实验室内进行）。
从固定液中选取大小基本一致、开花进程相近的花朵10个，从花中取下花药，用1.0mol/LHCl软化花粉壁。
然后细心的解剖花药，将花粉全部移人1个有刻度的离心管，用蒸馏水定容至5ml。
在水浴锅中于60℃下水解15min，震荡摇匀后用移液枪吸取1µl的花粉液于载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，每朵花重复5次。
将子房置于载玻片上，将胚珠从胎座中解开，观察并计数。
每朵花的花粉/胚珠比率用其花药中的花粉数除以其子房中的胚珠数得出。
依据Cruden[9]的标准进行授粉方式的判断。
C.草果花粉活力和柱头可授性
花粉活力测定
材料及试剂：
每类花序各20个（在未开花时事先套袋），载玻片，I2—KI试液（配方：
碘化钾3g；蒸馏水100ml；碘1g
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至100mL，保存在棕色玻璃瓶内。
）
方法：
用I2—KI染色法测定花粉活力，标记生长期相近花序每种类型20个，开花前套袋至单花花期结束。
开花当天每隔2h取样观察。
每个花序取3朵花，花粉混匀，取少量的混匀花粉于洁净的载玻片上，加水一滴，使花粉散开，再加一滴I2—KI溶液，盖上盖玻片，置于室温下2h后，置于光学显微镜下观察5个视野，。
凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉，统计花粉中红色花粉数及蓝色花粉数，计算花粉活力=蓝色花粉数/（蓝色花粉+红色花粉），即活力花粉占总花粉数的比例。
测定开花前的花粉是否具有活力，开花以后每天测定花粉活力1次，直至花朵凋谢为止。
柱头可授性
材料及试剂：
每类标记20个花序，联苯胺+过氧化氢反应液，凹面载玻片。
方法：
每种类型标记20个花序，在开花前随机标记当天将要开放的花，开花后每隔2h分别取20朵花的雌蕊，将其浸入含有联苯胺+过氧化氢反应液（1%联苯胺：
3%过氧化氢：
水=4：
1l：
22（体积比））的凹面载玻片中，若柱头具可授性，则柱头周围呈现蓝色并有大量气泡出现。
以气泡的多少来标记柱头可授性的大小。
在柱头上举时间段，要增加测量密度。
测定开花前的柱头是否具有可授性，开花以后每天测定柱头可授性1次，直至花朵凋谢为止。
传粉（杂交）试验
注：
套袋要套整个花序，每个处理的花序记录开花朵数以统计座果率，或每个处理的花序留下的花朵数相同。
材料及试剂：
标记每种草果植株各120株，标记牌（事先写好），硫酸纸袋，纱网袋，75%酒精（用于消毒），镊子，手套。
注：
本实验共计需硫酸纸袋约350个，纱网袋约40个。
方法及步骤：
CK、对照，不套袋、不去雄、自由传粉，用于检测自然条件下的传粉情况（每种类型30株）。
C1A、自发的自花传粉，开花前用硫酸纸袋套袋、不去雄，检测是否需要传粉者。
（每种类型30株）。
已经开放的花要摘掉（最好选择还未开花的花序直接套袋）
C1B、自花传粉，开花前用硫酸纸袋套袋、不去雄，开花后收集自花花粉，并在柱头打开后人工授于柱头上，。
（每种类型30株）。
已经开放的花要摘掉（最好选择还未开花的花序直接套袋）
C2、同株异花传粉，开花前用硫酸纸袋套袋，避免异株花粉干扰。
选择将要开的花朵（用显微镜检测柱头上未落有花粉），去雄、用硫酸纸套袋，同株异花之间人工传粉，检测是否自交亲和。
（每种类型30株）。
花序上未开的花芽应摘除。
C3A、同种类型间人工异株异花传粉，开花前用硫酸纸袋套袋，开花当天去雄、用同种类型不同植株的花粉进行传粉，用硫酸纸套袋，检测杂交是否亲和。
即OOU类型花粉授在OOU类型花朵上（30个花序）OND类型花粉授在OND类型花朵上（30个花序）
C3B、不同类型间人工异株异花传粉，开花前用硫酸纸袋套袋，开花当天去雄、用不同类型植株的花粉进行传粉，用硫酸纸套袋，检测杂交是否亲和。
即OOU类型花粉授在OND类型花朵上（30个花序），OND类型花粉授在OOU类型花朵上（30个花序）。
C4、检测无融合生殖，去雄、用硫酸纸套袋、不传粉，检测无融合生殖情况。
（30个花序）
C5、风媒的异花传粉。
套纱布（花粉能透过），隔离昆虫，去雄，检测座果状况是否受采粉者限制（30个花序）。
C6、自然条件下的异花传粉，不套袋，去雄，自由传粉，检测异花花粉对其结实的贡献。
（30个花序）
试验期间，对套袋的花朵经常进行检查，揭袋换气、防止花朵霉坏，揭袋时严格防止昆虫在花间活动。
果实成熟时，分株分朵收集，统计结果率。
D.草果传粉系统
花粉密度日变化
材料：
玻片，甘油（若无可用食用植物油代替），显微镜
方法：
采用玻片捕捉法测定空气中花粉密度，以载玻片上每平方厘米捕捉到的花粉数代表该时间段内空气中的花粉密度。
具体做法是，于盛花期按东南西北4个方向设置花粉采集器，即一面均匀涂满甘油的载玻片，涂面朝上置于离开花群体lm处。
7：
00-18：
00每隔1h收片一次，并重新置片。
在显微镜10倍视野下，每张玻片随机选择5个视野，统计花粉数量。
访花昆虫种类和行为的观察
材料：
每种材料各随机标记5株，相机。
方法：
每种类型分别随机标记5株已开放的花序连续观察5d，7：
00到18：
00之间，每小时统计30min内在标记花序上出现的各种访花昆虫数量和种类，对每种昆虫的访花行为进行摄影、描述，记录访花速率、停留时间。
访花速率、停留时间是随机观察10只访花昆虫在lmin内访问的花朵数和在花中滞留时间的平均值。
并收集部分访花昆虫带回学校用于分类鉴定和检验是否带有花粉及其附着位置。
不同花部处理对传粉的影响
材料：
标记牌，镊子，每种类型植株各10株。
方法：
A组去除雄蕊
B组去除花瓣
C组去除雄蕊和花被片
D组去除萼片
D组对照组
四组处理，对每一个个体均挂牌标记，第二天，取下柱头，放入固定液中固定，镜检，统计柱头上花粉的数目。
座果率与资源限制型
方法：
花粉限制：
选取60个花序，标记类型，记录总花数，进行人工辅助授粉。
（应进行多次）
疏花：
0，10%，20%，50%，80%
去叶片：
去除叶片1/4，1/2，3/4（因可能对农民收入重大影响，可不做）
大小孢子发育和雌雄配子体发生的研究
方法：
在开花期，采集草果各种大小的花蕾。
用卡诺固定液固定，带回实验室。
操作方法同花粉在柱头萌发的荧光镜观察。
石蜡切片制作标准操作程序
一、器材和试剂准备
草果柱头，苏木精，冰醋酸，甘油，蒸馏水，苯酚（石碳酸），石蜡，酒精，铁矾（硫酸铁铵），手术刀及刀片，手套，大小量筒，酒精灯，大小烧杯，石棉网，搪瓷杯，牛皮纸，染缸，中性树胶，玻片，盖玻片等。
（一）载玻片和盖玻片的清洁
1.载玻片和盖玻片清洗方法
（1）锅内倒入适量清洗液（100mL水+30mL洗洁精+30mL84消毒液）；
（2）将玻片逐片放入锅中,加热至沸腾10min,停止加热,自然冷却;
（3）捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）;
（4）将玻片从水中取出,用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）;
（5）将玻片放入95%乙醇（分析纯）中浸泡；
（6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用；
注意：
由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。
2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理
（1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合。
一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。
（2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。
二、石蜡组织切片的制作
（一）取材
注意事项：
1.材料质量：
材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。
2.取材体积：
组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳）
3.取材力度：
取材器具锋利。
勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。
夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。
取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。
4.固定形状：
固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。
为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。
对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。
5.切向选择：
选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。
纵切或横切根据观察目的而定。
6.材料冲洗：
保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，先用生理盐水冲洗，然后再入固定液。
7.组织清除：
切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。
（二）固定
1．固定液体积为固定组织的20倍为宜，在固定的初期，注意间断性的轻轻摇动。
2.固定时间，至少24h。
3.对肺组织
附件：
双固定液即多聚甲醛—戊二醛混合固定液:
（光镜和电镜均可）
（I）0.2M（mol/L）,pH=7.4PB（磷酸盐缓冲液）
每1升0.2MPB中含
NaH2PO4·2H2O（Mr=156）……………………………3g
Na2HPO4·12H2O（Mr=358）…………………………29g
先加1种盐溶解后再加入另一种。
如果要求较高，可以灭菌。
（II）10%多聚甲醛溶液的配制
多聚甲醛10g，加入100mL去离子水中，加1N氢氧化钠溶液5滴，水浴锅加热到70℃，边震荡边加入1N氢氧化钠溶液直至溶液澄清（约需5滴），冷却备用。
1N（=1mol/L）氢氧化钠溶液:
4g氢氧化钠，溶于100mL去离子水，用硬质塑料广口试剂瓶装。
（III）2.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液1L
10%多聚甲醛200mL
25%戊二醛100mL（如果为50%戊二醛时，用50mL）
0.2MPB500mL
去离子水补致1000mL
（三）修快和洗涤
1.修块之前（或之后），需要用自来水对组织块进行洗涤。
最好将块修好后，标记好，放在密闭的镂空铁盒中微流水冲洗。
一般新固定的组织冲洗6-8h，长期固定的组织24-48h。
2.修快厚度2-3mmX15mmX15mm。
修块的目的是为了，后面的包埋，特别要注意切向和切面问题，切面要平整，以方便在包埋时能立在纸盒中。
一定要至少保留将来的切片中至少能见到有一面为组织器官的被摸面，其他面如需要修整，最好取直角，方便展片。
（四）脱水
程序：
50%酒精（30min）→70%酒精（30min）→80%酒精（30min）→95%酒精I（30min）→95%酒精II（30min）→纯酒精I（30min）→纯酒精I（30min）
注意：
（1）高于80%的酒精不能时间过长，否则组织易脆。
（五）透明
程序：
酒精-二甲苯（2:
1）（6h），纯酒精-二甲苯（1：
1）（6h）→二甲苯I（过夜，不超过10h）→二甲苯II（过夜，不超过10h）→二甲苯II（过夜，不超过10h）
注意：
透明时间一般取短（10min），以组织块刚透明为宜。
（六）浸蜡
常温放置小蜡块于瓶中2-3天→放置烘箱40度1天→调温至60℃，2/3剩余液1/3蜡（10h）→1/3剩余液2/3蜡10h→全蜡三次10h/次（过夜）
程序：
石蜡（52-58℃）I（30min）→石蜡（52-58℃）II（30min）→石蜡（52-58℃）III（30min）
注意：
（1）温箱温度一般高于蜡的熔点5℃，设定在65-70℃。
（2）蜡必须提前加热融化后，放入温箱内保温平衡2-4h。
（3）尽量将透明的二甲苯控净。
（七）包埋
1.切面向下，每个蜡块可以包2-4个组织，每个纸盒可以包多个蜡块。
2.先将热包埋蜡（可以加适当比例蜂蜡）倒入纸盒内，用小镊子摆好组织块，全过程有电热吹风机吹热分，以保证蜡处于融化态。
3.迅速冷却，等表面凝固后轻轻将蜡盒转移到冷水，加速凝固。
（八）切片、展片和烤片
1.修块：
修成正方形、长方形或梯形，受刀面一定要平行，组织周围留约2mm的石蜡边。
2.粘块：
有时要将蜡块牢固地粘到小木块上，注意切面和受刀面平直。
如果气温高粘好块后，可以放在4℃冰箱里，先预冷。
3.刀要锋利，刀口要与切面（约25度角）和受刀面平行。
先20-50微米的粗切修面，然后调到5微米。
为连成带状，需要哈气，增加水汽表面张力，使切片展开。
毛笔转入干净硬纸上。
4.水浴40℃左右。
先用拨针将蜡片分开，光面贴水，在水浴中展开后拨去多余的蜡。
5.用载玻片（注意标记和记录）捞取组织，并调节到最佳位置。
一张载波片上可以放1-3块蜡片。
将玻片水平放在玻片板上，放在空气中或37℃烘箱内晾干。
（九）染色
将烤好的切片，用弹簧夹夹好，（注意有组织面方向要朝向一面，边上的一块保证组织面向里。
常规石蜡切片HE染色程序简介
步骤
试剂
时间
1
二甲苯I
10min
2
二甲苯II
10min（脱蜡必须完全）
3
1/2二甲苯
10min
4
无水乙醇I
5min
5
无水乙醇II
5min
6
95%乙醇I
5min
7
95%乙醇II
5min
8
80%乙醇
5min
9
50%乙醇
5min
10
30%乙醇
5min
11
蒸馏水
3min
12
苏木素液
5min（可以适当延长）出时沥净过夜超过12h
13
流动自来水洗
5min
14
分色液：
铁矾
数秒（3-5Sec）
15
流动自来水洗
30min
16
80%乙醇
1-2sec
17
95％乙醇I
2-3min
18
95％乙醇II
2-3min
19
无水乙醇I
3-5min
20
无水乙醇II
3-5min
21
二甲苯I
3-5min
22
二甲苯II
3-5min
23
中性树脂封片
要等树脂凝固干燥后才能放入切片盒内
24
贴标签
注意：
二甲苯脱蜡和酒精脱水时，如果温度低可以考虑延长时间。
问题：
当实验进行至步骤13时，染色材料绝大部分脱落，而未脱落者经染色后呈现明显褐色。
经分析，原因可能是用于固定材料的石蜡易被染色剂溶解。
疑为实验方案存在问题，有待商榷，选取其他的石蜡切片制作方案。
补充：
1.座果率与资源限制型
2.不同花部处理对传粉的影响
3.传粉（杂交）试验
（以下说明对于上述三个实验均适用）
1.于草果成熟季节（红河州绿春县一般为10月1日左右）及时采集鲜果，连同对应号牌置于自封袋内，回校后须立即称重，防止水分蒸发；若条件允许，则在实验基地一并完成。
在称量草果鲜重时应除去果柄，采用大量程电子称称量，以减小实验误差。
同时，注意统计各个处理对应的鲜果数；
2.草果鲜重称量结束后，立即将其放入烘箱内，在80℃恒温烘烤48h,直至干至恒重时取出。
注意，在放入烘箱前须进行分类后用耐高温材料（如牛皮纸袋）包好，放置于瓷盘内，再转移到烘箱内。
3.烘干后及时取出，为保证实验的严谨性和数据的真实性，须立即称量干重和千粒重，降低实验室空气湿度对干草果的影响。
说明
1.该实验方法由于实验者思维有限，可能不尽完善，仅供参考，需要在实地操作中完善提高。
2.在每次试验前，需预先制作规划任务，明确目标，有条不紊进行实验。
3.为确保万无一失，所有号牌须作两面标记，一面用记号笔，一面用铅笔，同时，为防止人为因素带来的影响，相关实验的号牌须悬挂于草果的果柄上；
4.当地农民可能会提前收获草果，所以需要随时与相关负责人保持联系，以确保实验材料的完整性；
5.为提高效率，各实验项目可交叉进行。
6.在试验地，由于地形条件复杂，天气多变，为便于观察，可用手电作为显微镜的辅助光源。
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