API含量测定验证方案1.docx
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API含量测定验证方案1
API含量测定验证方案1
API含量测定方法验证方案
CCC制药有限公司
验证方案起草、审核、批准表
起草部门
起草人
职称
职务
日期
质检部
审核部门
审核人
职称
职务
日期
质保部
批准人
签名
日期
质量副总经理
计划验证时间
2008年9月
验证小组人员名单
组长
姓名
部门
职务
1、概述………………………………………………………………………………………………5
2、试验所需仪器……………………………………………………………………………………5
3、试剂和样品………………………………………………………………………………………5
4、色谱条件…………………………………………………………………………………………5
5、溶液配制…………………………………………………………………………………………5
6、专属性试验………………………………………………………………………………………6
7、溶液稳定性试验…………………………………………………………………………………6
8、线性试验…………………………………………………………………………………………7
9、回收试验…………………………………………………………………………………………7
10、精密度试验……………………………………………………………………………………8
11、检出限和定量限………………………………………………………………………………9
12、含量测定方法评价……………………………………………………………………………10
1、概述
通过对API含量测定方法的验证，得到可信赖的和准确的数据，用于药品的含量测定，从而验证该方法的可行性。
2、试验所需仪器
分析天平（灵敏度为0.01mg）型号编号有效期
液相色谱仪型号编号有效期
3、试剂和样品
乙腈HPLC级
API标准品USP标准品
API有关物质AUSP标准品
有关物质BUSP标准品
有关物质CUSP标准品
4、色谱条件
色谱柱：
4.6mm×10cmC8柱，其填料粒径为3.5微米
检测波长：
254nm
流速：
1.0ml/min
进样量：
20μl
柱温：
40℃
流动相：
A溶液和B溶液不同比例的混合溶液。
（见下表）
其中，稀释液——水：
乙腈（60：
40）
A溶液——水：
乙腈（70：
30）
B溶液——水：
乙腈（50：
50）
时间（分钟）
A溶液
B溶液
洗脱方式
0-6.5
100→50
0→50
线性梯度
6.5-10
50→0
50→100
线性梯度
10-20
0
100
衡梯度
20-20.1
0→100
100→0
线性梯度
20.1-28
100
0
衡梯度
5、溶液配制
系统适应性溶液：
取API标准品和API相关物质A和相关物质B标准品，精密称定，用稀释液配制成0.05mg/ml的溶液。
标准溶液：
取适量API标准品，用乙腈溶解，超声处理，得到1.0mg/ml的溶液。
取4ml该溶液置于10ml容量瓶中，用水稀释至刻度。
用稀释液进一步稀释，即得浓度为0.04mg/ml的溶液。
供试溶液：
取本品约20mg，置于50ml容量瓶中，精密称定，用20ml乙腈溶解（可以超声处理），然后用水稀释至刻度。
吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得。
6、专属性试验
取系统适应性溶液注入色谱系统，记谱色谱图，API相关物质B（离API峰最近的杂质峰）与API峰的分离度应不小于1.5，各杂质峰分离良好，同时取稀释液作空白溶液，注入色谱系统，记谱色谱图，在API出峰处无干扰峰出现。
同时与API降解试验结果对比，各降解产物峰在API峰处无干扰，不影响API测定。
7、溶液稳定性试验
取本品约20mg，置于50ml容量瓶中，精密称定，用20ml乙腈溶解（可以超声处理），然后用水稀释至刻度。
吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得制成供试品溶液。
取供试品溶液分别于0小时，2小时，4小时，6小时，8小时注入色谱系统，记谱色谱图，记录API峰面积，8小时内API峰面积的相对标准偏差（RSD%）不大于2.0%。
时间（h）
0
2
4
6
8
RSD（%）
API峰面积
8、线性试验
200%标准贮备溶液：
取API标准品20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用20ml乙腈溶解（可以超声处理），然后用水稀释至刻度。
精密吸取10ml此种溶液置于50ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得浓度为0.08mg/ml的200%的标准贮备溶液。
160%标准溶液：
精密移取8.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
120%标准溶液：
精密移取6.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
100%标准溶液：
精密移取5.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
80%标准溶液：
精密移取4.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
40%标准溶液：
精密移取2.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
20%标准溶液：
精密移取1.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。
分别取上述线性供试品溶液注入液相色谱仪，记录API峰面积，以API的峰面积对其浓度进行一元线性回归，其相关系数（R）不小于0.999。
线性溶液
20%
40%
80%
100%
120%
160%
200%
浓度（mg/ml）
0.008
0.016
0.032
0.04
0.048
0.064
0.08
峰面积
线性方程
Y=ax+b
相关系数
r2=
r=
9、回收试验（标准加入法）
标准溶液：
按方法要求制备
供试品溶液：
按方法要求制备
120%加标供试品溶液：
以线性试验中120%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。
100%加标供试品溶液：
以线性试验中100%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。
80%加标供试品溶液：
以线性试验中80%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。
测试法：
分别吸取上述配制好的溶液，按前述色谱条件进样，记录API峰面积，按下式计算回收率，要求回收率在98%~102%范围内，9个回收率的RSD%应不大于2.0%。
供试品
样品号
1
平均值
峰面积
100%标准溶液
样品号
1
2
3
4
5
6
平均值
峰面积
80%加标供试品
样品号
1
2
3
峰面积
回收率%
100%加标供试品
样品号
1
2
3
峰面积
回收率%
120%加标供试品
样品号
1
2
3
峰面积
回收率%
回收率的RSD%
10、精密度试验（系统精密度，重复性和方法中间精密度试验）
方法重复性-1：
第一天（不同人或不同仪器），按5中供试品配制方法，平行配制六份样品，按含量测试法进行测定，六份样品检测结果的相对标准偏差（RSD）不大于2.0%。
方法重复性-2：
第二天（不同人或不同仪器），按5中供试品配制方法，平行配制六份样品，按含量测试法进行测定，六份样品检测结果的相对标准偏差（RSD）不大于2.0%。
每次新鲜配制标准溶液和供试品溶液。
方法中间精密度：
两次方法重复性的12个结果的RSD%应不大于3.0%。
系统精密度：
两次方法重复性试验的标准溶液的6次重复进样峰面积的RSD%应不大于2.0%。
标准溶液重复进样结果
样品份数n
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD%
系统精密度-1
系统精密度-2
含量%
样品份数n
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD%
方法重复性-1
方法重复性-2
中间精密度
11、检出限和定量限
对线性溶液中20%的标准溶液的S/N进行评价，定量限S/N应不小于10，检出限S/N应不小于3。
式中：
CDL——检出限（g/ml）
CQL——定量限（g/ml）
C——样品浓度（g/ml）
S/N——信噪比
1
2
3
信噪比
定量限保证浓度
检出限保证
12、含量测定方法评价
附：
我们的相关提问：
1、上面5中标准溶液的配制是直接从USP31中翻译过来的，但我们觉得那种说法很繁琐，并且标准溶液和样品溶液配制方法不一致，我们觉得直接按它的供试品溶液配制方法配制标准品挺好的，后面验证时我们也是就按供试品溶液配制法配的标准溶液。
不知是否妥当，请你们参考一下。
有关物质验证时也涉及到这个问题。
2、含量方法中间精密度12个数据的RSD%多少合适，相关物质呢？
我们以前做国内只做过6个数据的评价。
3、原料药的回收试验怎么做啊，请指点一下。
上面我们是按你们给我们残留溶剂的方案套用过来的。
我们以前做国内一般都不做原料药的回收试验，而是直接从精密度等其他验证项目中推论而得。
我们只做过制剂的向空白辅料里加原料的回收试验。
4、我们的含量和相关物质都是按USP31方法做的，是不是实际上只需做精密度，溶液稳定性，专属性，降解试验就可以了?
5、我们看了一下Q2A，含量测定时是不是不需做检出限和定量限？
6、在上面的含量方案里我们把所有验证内容都理出来了，还是请你们一一给我们审阅一下，把你们的建议给我们提出来。
非常的感谢！
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