蛋白质组学实验方法.docx

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蛋白质组学实验方法

2、蛋白质分离的双向电泳过程

2．1溶液配制

常用水化上样缓冲液

（Ⅰ）

尿素8M4.805g

CHAPS4%0.4g

DTT65Mm0.098g

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）

溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml

（Ⅱ）

尿素7M4.2g

硫脲2M1.52g

CHAPS4%0.4g

DTT65Mm0.098g

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）

溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml

（Ⅲ）

尿素5M3.0g

硫脲2M1.52g

SB3-102%0.2g

CHAPS4%0.4g

DTT65Mm0.098g

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）

溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml

分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液母液

尿素6M36g

SDS2%2g

Tris-HCl0.05MpH8.83.3ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）

甘油20％20ml

MilliQ水定容至100ml

分装成10管，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液Ⅰ

胶条平衡缓冲液母液10ml

DTT0.2g

充分混匀，用时现配。

胶条平衡缓冲液Ⅱ

胶条平衡缓冲液母液10ml

碘乙酰胺0.25g

充分混匀，用时现配。

低熔点琼脂糖封胶液

低熔点琼脂糖0.5％0.5g

Tris25mM0.303g

甘氨酸192mM1.44g

SDS0.1%1ml（10%SDS）

溴酚蓝0.001％100μl（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml

加热溶解至澄清，室温保存。

30％聚丙烯酰胺贮液

丙烯酰胺150g

甲叉双丙稀酰胺4g

MilliQ水500ml

滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

1.5mol/LTris碱pH8.8

Tris碱90.75g

MilliQ水400ml

用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml,4℃冰箱保存。

10%SDS

SDS10g

MilliQ水100ml

10%过硫酸铵

过硫酸铵0.1g

MilliQ水1ml

现用现配。

10×电泳缓冲液

（1×＝25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3）

Tris碱30g

甘氨酸144g

SDS10g

MilliQ水1L

混匀后，室温保存。

2．2操作步骤

2.2.1第一向等电聚焦

1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。

具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，

ReadyStripTMIPG胶条长度

上样体积

分析型的上样量

（银染）

制备型的上样量

（考马斯亮兰染色）

7cm

125-250μl

10-100ug

200-500ug

17cm

300-600μl

100-300ug

1-3mg

2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。

3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。

4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。

确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。

5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

6.对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

7cm胶条

水化12h（17-20℃）主动水化

S1250V慢速2h除盐

S2500V慢速1h除盐

S31000V快速1h除盐

S44000V线性3h升压

S54000V快速25000伏h聚焦

S6500V快速任意时间保持

17cm胶条

水化12h（17-20℃）主动水化

S1250V慢速2h除盐

S2500V慢速1h除盐

S31000V快速1h除盐

S48000V线性5h升压

S58000V快速60,000伏h聚焦

S6500V快速任意时间保持

●选择所放置的胶条数。

●设置每根胶条的极限电流。

●设置等电聚焦时的温度。

7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。

2.2.2第二向SDS－PAGE电泳

1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。

待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。

2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。

3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。

将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。

这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。

4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。

将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。

5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。

再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。

6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。

将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。

用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。

注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。

10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。

11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：

5-10mA/gel；17cm胶条：

10mA/gel）或低电压（7cm胶条：

50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流（7cm胶条：

10-15mA/gel；17cm胶条：

20-30mA/gel）或电压（7cm胶条：

150-200V/gel；17cm胶条：

300-400V/gel），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。

然后进行染色。

2．3染色方法

2.3.1考马斯亮蓝G-250染色

固定液：

45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸

G-250染色液：

17％（W/V）硫酸铵，34％（V/V）甲醇，0.5％（V/V）乙酸，0.1％（W/V）G-250.

步骤：

1.固定液固定20min或过夜（无需固定液可）。

2.倒出固定液

3.加入G-250染色液，18-24h。

4.倒出染色液

5.用水洗（20min一次，45～55℃温水有助于水洗）

6.可用塑料包裹，4℃贮于密封盆里。

2.3.2胶体考染法

1.用去离子水清洗凝胶两次，每次10min，以去除SDS。

2.固定：

50％乙醇/10％冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。

3.染色：

染色液为45％甲醇/10％冰醋酸/0.25％G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h。

4.脱色：

多次更换脱色液（25％乙醇/8％冰醋酸溶液）直至背景脱净。

5.保存：

用保险膜包裹，可存一个月。

2.3.3银染法

步骤试剂体积（ml）不同类型胶所需时间（min）

1mm1.5mm

1.固定10％乙酸/40％乙醇/水2×2502×152×60

2.敏化75ml乙醇/17g乙酸钠/

10ml5%Na2S2O3/2503060

1.25ml戊二醛/加水至

3.水洗去离子水3～5×2503×155×8

4.银染25mlAgNO3（2.5%）/

100μl甲醛/加水至2502060

5.水洗去离子水2～4×2502×14×1

6.显色6.25gNa2CO3/100μl甲醛

7μlNa2S2O3（5%）25046

7.停止3.65gEDTA加水至2501040

8.水洗去离子水2～3×2503×52×30

3、等电聚焦蛋白样品的浓度检测

3．1Bio-RadRCDCProteinAssay微离心管检测方法

（1）将5μlDC试剂S与250μlDC试剂A混合（试剂A’），每份样品或标准溶液需要127μl试剂A’。

（2）将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液，在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。

（为得到最佳结果，标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液）

（3）从每份样品或标准蛋白中取出25μl，分别加至清洁、干燥的微离心管中。

（4）向每管中加入125μlRC试剂Ⅰ，混旋后室温放置1min。

（5）向每管中加入125μlRC试剂Ⅱ并混旋，之后在15，000×g速度下离心3-5min。

（6）吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。

（7）向每个微离心管中加入127μl试剂A’并混旋，在室温下放置5min或直至沉淀彻底溶解。

在进行下一步之前再次混旋。

（8）在每个管中加入1mlDC试剂B，立即混旋，室温下放置15min。

（9）在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。

3．2Bradford法

1、溶液的配制

Bradford储存液

100ml95%乙醇

200ml88%磷酸

350mg考马斯亮蓝G-250

室温下长期保持稳定。

Bradford工作液

425mlMilliQ水

15ml95%乙醇

30ml88%磷酸

30mlBradford储存液

Whatman1号滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，用前过滤。

2.1mg/mlBSA蛋白质标准溶液

10mgBSA标准蛋白

10mlMilliQ水

分装成10小管，-20℃冰箱保存。

2、标准曲线的测定

IDBSA蛋白质MilliQ水BradfordAbs

标准溶液（μl）（μl）工作液（ml）（A595）

Blank010010

010010

12.597.510.0656

2.597.510.0656

259510.1626

59510.1852

37.592.510.2248

7.592.510.2543

4109010.2611

109010.3020

512.587.510.3034

12.587.510.3080

6158510.3218

158510.3523

717.582.510.3514

17.582.510.4236

8208010.4279

208010.4234

3、未知蛋白浓度的测定

步骤：

（1）将未知蛋白溶液移至试管，补加MilliQ水至100μl。

（2）加入1mlBradford工作液，充分混匀。

（3）3.2min后测A595的OD值。

（4）根据测得的A595的OD值，及未知蛋白的稀释倍数，即可算出未知蛋白的浓度。

3．3考马斯亮蓝G-250染色法

1、溶液的配制

（1）染色液配制

95％乙醇50ml

85％磷酸100ml

考马斯亮蓝G-250100mg

用MilliQ水稀释定容至1000ml,滤纸过滤，保存于棕色瓶中，4℃冰箱备用。

（2）300ug/ml标准蛋白质溶液配制

BSA标准蛋白质30mg

MilliQ水定容至100ml

2、标准曲线的测定

ID标准蛋白质MilliQ水蛋白浓度染色液ABS

溶液（μl）（μl）（ug/ml）（ml）（A595）

101000030

01000030

2509501530.2879

509501530.2884

31009003030.4912

1009003030.4948

42008006030.7835

2008006030.7901

53007009031.0738

3007009031.0775

640060012031.1804

40060012031.1831

750050015031.2663

50050015031.2712

860040018031.3434

60040018031.3497

980020024031.4482

80020024031.4505

101000030031.4802

1000030031.4837

注：

充分混匀，室温（20-25℃）保温15min。

4、未知蛋白浓度的测定

步骤：

对照管×2样品管×2

待测样品（μl）0500

MilliQ水（μl）1000500

染色液（ml）3.03.0

样品管中的蛋白可根据需要选择稀释倍数。

充分混匀，室温20-25℃保温15min。

测A595处的OD值。

计算：

蛋白质样品提取、裂解条件对蛋白质谱的影响较大，尤其是蛋白质提取的缓冲液性质是影响电泳图谱的关键。

本章在前一章的基础上，重点优化蛋白质提取缓冲液、样品

裂解液、电泳条件等技术方案。

1材料与方法

1．1供试材料

供试黄瓜品种为山东密刺。

将种子催芽后播在装有草炭土：

蛭石为1：

2（体积比）的营养钵中，温室中培养，待黄瓜长至两片真叶时，取第二片真叶，称取后置于-80℃冰箱中待用。

1．2SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度的比较

1D样品的提取和SDS-PAGE：

样品液氮研磨，按1/5的比例加提取液（pH6.8的0.0625MTris-HCL,0.5%SDS，5％甘油，3％β-巯基乙醇和10％TritonX-100）-4℃提取1h，10000rpm-4℃下离心20min。

取上清液，加4倍体积的丙酮溶液，-20℃沉淀过夜，10000rpm-4℃下离心20min，去除上清，沉淀冷冻干燥。

24mg蛋白干粉加1ml蛋白样品处理液（2％SDS，5％巯基乙醇，10％甘油，0.02％溴酚蓝，0.125MpH8.0Tris-HCL）,沸水浴3-5min，冷却后供点样用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度分别为7.5％、10％、12％、15％，浓缩胶浓度为4％。

具体配制参照下表3-1。

1．3双向电泳中黄瓜叶片蛋白质不同提取方法比较

1.3.1三氯乙酸/丙酮法（TCA/acetone法）:

取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20℃冰箱过夜。

之后4℃下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用含0.2%DTT的丙酮溶液清洗三次（每次均放于-20℃冰箱沉淀1h）。

最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。

1.3.2DTT/丙酮法:

取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含2%DTT的水溶液匀浆。

之后4℃下1000rpm离心30min，取上清液，弃沉淀。

上清液加4倍体积的冷丙酮，放置于-20℃冰箱过夜。

之后4℃下13000rpm离心30min，沉淀用80%丙酮溶液清洗三次（每次均放于-20℃冰箱沉淀1h）。

最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。

1.3.3酚提取法:

取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加3ml提取液（1%PVPP,0.7M蔗糖,0.1MKCL,0.5MpH7.5Tris-HCL,500mMEDTA,1MmPMSF,2%β-巯基乙醇），4℃下1000rpm离心30min，取上清液加等体积的Tris酚，4℃下放置30min，之后10000rpm离心15min，取酚相上清液。

此过程反复提取2-3次。

最后酚相用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20℃沉淀过夜。

之后13000rpm离心30min,沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗三次,再用冷丙酮洗一次,最后沉淀冻干,放于-80℃冰箱待用。

1.3.4三氯乙酸/丙酮法/酚（TCA/acetone/phenol）提取法:

取1g植物叶片，液氮冷冻研磨,加4ml冷丙酮,4℃下13000rpm离心3min，再用冷丙酮洗两次并离心。

沉淀转入研钵中,室温干燥20min。

干粉末重新研得更细，并转到新管中，得到得组织粉末用10%冷TCA/丙酮溶液清洗3-4次，直到上清液无颜色为止。

最后用80%冷丙酮洗两次，每次沉淀彻底重新旋弃，并离心。

取0.05~0.1g干粉末在2.0ml管里重新悬浮于0.8mlTris酚和0.8mlSDS溶液（含30%蔗糖,2%SDS,0.1MTris-HCLPh8.0,5%β-巯基乙醇）中。

该混合物彻底涡旋30S,4℃下13000rpm离心30min，酚相移到新管中，用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20℃沉淀过夜。

之后13000rpm离心30min，沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗两次，再用80%冷丙酮洗两次，最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。

表3-1SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配置

Table3-1FormulationsforSDS-PAGESeparatingandStackingGels

SeparatingGel

（0.375MTris,pH8.8）

StackingGel

（1.25MTris,pH6.8）

MonomerConcentration（%T,2.67%C）

7.5%

10%

12.5%

15%

4.0%

Acrylamide/bis（30%T,2.67%CStock）

Distilledwater

1.5MTris-HCl,pH8.8

0.5MTris-HCl,pH6.8

10%（W/V）SDS

10%ammoniumpersulfate（fresh）

TEMED

TOTALMONOMER

25.0ml

48.5ml

25.0ml

-

1.0ml

500μl

50μl

100ml

33ml

40ml

25ml

-

1.0ml

500μl

50μl

100ml

41.625ml

31.875ml

25.0ml

1.0ml

500μl

50μl

100ml

50.0ml

23.5ml

25.0ml

-

1.0ml

500μl

50μl

100ml

1.3ml

6.1ml

-

2.5ml

100μl

50μl

10μl

10ml

第一向IEF采取IEF方法（Ⅱ）。

第二向SDS-PAGE电泳分离胶浓度为15％，电泳条件为20V/gel20min,80V/gel2h。

G-250胶体考染法染色。

1．4不同裂解缓冲液的比较

Buffer1

5MUrea3g

2Mthiourea1.52g

100mMDTT146.4mg

0.4%CHAPS40mg

0.25%SB3-1025mg

Carrierampholyte25μl（40%）

Bromophenolblue20μl（1%）

0.25%Tween2025μl

10%Isopropanol1.0ml

12.5%Saturatedisobutanol1.25ml

5%Glycerol0.5ml

加MilliQ水至10ml

Buffer2

8MUrea4.8g

2Mthiourea1.52g

100mMDTT146.4mg

0.4%CHAPS40mg

0.25%SB3-1025mg

Carrierampholyte25μl（40%）

Bromophenolblue20μl（1%）

0.25%Tween2025μl

10%Isopropanol1.0ml

5%Glycerol0.5ml

加MilliQ水至10ml

Buffer3

5MUrea3g

2Mthiourea1.52g

20mMDTT30.8mg

2mMTBP100μl

2%CHAPS0.2g

2%SB3-100.2g

0.5%Carrierampholyte125μl（40%）

Bromophenolblue20μl（1%）

0.25%Tween2025μl

10%Isopropanol1.0ml

5%Glycerol0.5ml

加MilliQ水至10ml

Buffer4

9.5MUrea5.7g

2Mthiourea1.52g

1%DTT0.1g

2mMTBP100μl

4%CHAPS0.4g

0.2%Carrierampholyte50μl（40%）

Bromophenolblue20μl（1%）

0.25%Tween2025μl

10%Glycerol3.3ml（30%）

10mMPMSF500μl（200mM）

加MilliQ水至10ml

Buffer5

7MUrea4.8g

2Mthiourea1.52g

20mMDTT15mg

2mMTBP100μl

4%CHAPS0.4g

1%ASB-140.1g

0.5%TritonX-10050μl

0.5%Carrierampholyte125μl（40%）

Bromophenolblue20μl（1%）

0.25%Tween2025μl

10%Glycerol3.3ml（30%）

10mMPMSF500μl（200mM）

加MilliQ水至10ml

蛋白质样品制备采用TCA/丙酮法。

第一向等电聚焦采取IEF方法（Ⅱ）。

第二向SDS-PAGE电泳分离胶浓度为15％，电泳条件为20V/gel20min,80V/gel2h。

G-250胶体考染法染色。

1．5等电聚焦（IEF）条件的优化

（Ⅰ）7cm胶条

水化12h（17-20℃）主动水化

S1250V慢速25min除