检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19CEA mRNA的临床意义.docx

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检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19CEAmRNA的临床意义

检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19、CEAmRNA的临床意义

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___________）

【摘要】目的观察细巢式逆RTPCR检测老年胃癌患者腹腔冲洗液瘤细胞胞角蛋白19（CK19）、癌胚抗原（CEA）的临床价值。

方法收集45例进展期老年胃癌和8例胃良性病变患者腹腔冲洗液200ml，其中100ml行RTPCR检测CK19、CEA　mRNA，另100ml用于HE染色细胞学检查，胃癌细胞SGC7901为阳性对照。

结果45例老年胃癌病人腹腔冲洗液中CK19mRNA的阳性表达率为55.6%（25/45）;CEAmRNA的阳性表达率为51.1%（23/45）;CK19、CEAmRNA的联合检测阳性率为62.2%（28/45）。

细胞病理学检查45例胃癌病人有8例腹腔冲洗液中发现肿瘤细胞，阳性率为17.8%（8/45），且此8例CK19、CEAmRNA检测结果均为阳性。

CK19、CEAmRNA阳性率与肿瘤胃壁浆膜受侵、淋巴结转移和胃癌分期明显相关（P0.05）。

结论腹腔冲洗液中CK19、CEAmRNA检测胃癌细胞敏感性高。

初步临床观察显示此方法对于早期诊断胃癌患者腹腔种植有一定价值。

【关键词】胃癌;细胞角蛋白19;癌胚抗原;腹腔冲洗液

近年来老年胃癌病人逐渐增多，目前多采用以手术为主的根治术，但发现时多属中晚期故预后仍较差。

影响预后的主要因素之一是腹腔转移，腹腔脱落癌细胞（ECC）是腹膜转移之源〔1〕。

因此早期检出ECC，及时采取有效的干预措施，是改善胃癌病人预后的关键。

由于脱落的游离癌细胞数量少，浓度低，使得传统的细胞学检查（CY）阳性率低，有很高的漏诊率〔2，3〕。

细胞角蛋白19（CK19）在胃癌腹腔转移灶中的表达却存在争议。

以往巢式RTPCR技术检测CK19、癌胚抗原（CEA）mRNA已成功地运用于胃癌淋巴结、骨髓及血液微转移的研究，国内外少见用于胃癌腹腔微转移的研究，尤其关于老年患者更无报道。

本研究采用巢式RTPCR技术检测老年胃癌患者腹腔冲洗液中瘤细胞CK19、癌胚抗原（CEA）mRNA的表达，探讨其对早期诊断腹腔转移的临床实用价值。

　　1材料与方法

　　1.1检测对象标本来源于本院2006年9月至2007年2月接受手术的45例老年胃癌病人，均经手术及病理证实。

其中男性29例，女性16例，年龄60～76岁，中位年龄66岁。

临床病理学特征：

45例中大体浆膜受侵18例，病理累及浆膜31例，组织学类型高中分化28例、低分化17例，淋巴结有转移26例、无转移19例，病理分期Ⅰ+Ⅱ期21例、Ⅲ+Ⅳ期24例。

　　1.2方法

　　1.2.1标本制备开腹探查腹腔后，于Douglas窝或左膈下置入一根16号导尿管，注入200ml无菌生理盐水，在不触动原发灶的情况下，轻轻搅动后吸出，如有自然腹水则直接吸出。

所有标本均分成两部分，一部分送本院病理室行细胞学检查。

2500r/min离心10min，弃上清液，沉渣涂片，HE染色后镜检。

另一部分立即于4℃下2500r/min离心10min，弃上清液，置-80℃冰箱备用。

　　1.2.2mRNA提取采用mRNA抽提试剂盒（B.M公司）提取腹腔冲洗液离心沉渣mRNA，采用PrimeScriptTMRTase,2StepRTPCR试剂盒（宝生物工程有限公司）行逆转录。

操作步骤按照试剂盒说明书进行。

　　1.2.3巢式PCR扩增CK19、CEA产物宝生物工程（大连）有限公司合成引物序列。

CK19mRNA巢式PCR引物〔4〕：

A,5′AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC3′;B,5′TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC3′;C,5′TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC3′;D,5′CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC3′。

CEAmRNA巢式PCR引物〔5〕：

E,5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′;F,5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′;G,5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′。

内对照βactin引物序列〔6〕：

上游引物：

5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′;下游引物：

5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′。

PCR按说明书反应分两步，第一步模板为反转录的产物cDNA，CK19mRNA的引物为A、B,CEAmRNA的引物为E、F。

反应条件：

94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。

第二步取第一步扩增产物2μl，CK19mRNA的引物为C、D，CEAmRNA的引物为F、G，以同样步骤扩增30个循环。

　　1.2.4阴、阳性对照设置以胃癌细胞SGC7901相应mRNA为阳性对照，阴性对照组采用空白对照，即除不加模板外，其他各种成分与待测样品相同。

各样本βactin作为内对照。

　　1.2.5电泳取10μlPCR反应产物行2%琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳（100V，20min）以鉴定有无CK19、CEA特异性条带。

　　1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件包，进行χ2检验。

　　2结果

　　2.1腹腔冲洗液RTPCR检测结果45例胃癌病人中25例于745bp处见CK19的特异性条带，23例于136bp处见CEA的特异性条带，8例胃良性病变病人腹腔冲洗液RTPCR检测结果均为阴性。

细胞SGC7901是CK19、CEA表达的胃癌细胞株，作为阳性对照也在745bp、136bp处分别发现CK19、CEA的特异性条带。

各样本βactin对照均在相应位置出现明显扩增条带，表明提取的mRNA质量及RTPCR反应过程良好（见图1）。

　　2.2腹腔冲洗液各项指标的检查结果8例胃癌病人的腹腔冲洗液细胞学检查发现有肿瘤细胞，其他病人均未发现肿瘤细胞。

8例细胞学检查阳性的病人CK19、CEA的RTPCR检测结果均为阳性;17例CK19RTPCR结果阳性的病人细胞学检查未发现肿瘤细胞;15例CEARTPCR结果阳性的病人细胞学检查未发现肿瘤细胞。

细胞学检查阳性率为17.8%（8/45）;CK19RTPCR的阳性表达率为55.6%（25/45）;CEARTPCR的阳性表达率51.1%（23/45）;CK19、CEA联合检测阳性表达率为62.2%（28/45）。

统计学分析结果提示细胞学与巢式RTPCR两种检查方法差异有显著性（P0.05），CK19、CEA的RTPCR的检出率明显高于细胞学检查，CK19、CEA联合检出率高于CK19、CEA单一检测。

　　2.3胃癌临床病理学特征与CK19、CEARTPCR阳性率的关系腹腔冲洗液中CK19mRNA在病理浆膜受累组的阳性表达率为67.7%，而浆膜未及的阳性表达率为28.6%，差异有统计学意义（P0.05）;在胃癌淋巴结转移组的阳性表达率为80.8%，而淋巴结未转移组的阳性表达率为21.0%，差异有统计学意义（P0.05）;在胃癌病理分期为Ⅰ+Ⅱ期的阳性表达率为23.8%，而Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率为83.8%，差异有统计学意义（P0.05）。

见表1。

表1胃癌病理特征与腹腔脱落癌细胞检出率的关系

　　如表1所示，腹腔冲洗液中CEAmRNA在病理浆膜受累组的阳性表达率为64.5%，而浆膜未及的阳性表达率为21.4%，差异有统计学意义（P0.01）;在胃癌淋巴结转移组的阳性表达率为80.8%，而淋巴结未转移组的阳性表达率为10.5%，差异有统计学意义（P0.05）;在胃癌病理分期为Ⅰ+Ⅱ组的表达阳性率为19.0%，而Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率为79.2%，差异有显著性（P0.05）。

　　在胃癌的腹腔冲洗液中，CK19、CEAmRNA的表达与浆膜受累有关（P0.05），与病理分期有关（P0.05），与淋巴结转移有关（P0.05），而与肿瘤分化程度无关。

　　3讨论

　　腹腔复发转移是影响胃癌患者预后的主要因素之一，胃癌细胞通过侵犯浆膜或转移的淋巴结被膜等各种途径落入腹腔，是造成腹腔复发转移的根源〔7〕。

早期检出ECC、及时采取腹腔温热灌注化疗等有效干预措施是延长患者生存期的关键。

但传统的腹腔冲洗液细胞学检测敏感性低，漏诊率高，部分细胞学检测阴性的病人仍死于腹腔复发转移〔8〕。

腹腔冲洗液细胞学检测缺乏敏感性〔9〕，使得临床应用受到限制。

有报道应用多重RTPCR技术测定消化道肿瘤腹腔灌洗液中AFP、CEA和CK19mRNA表达，结果表明CK19mRNA对早期诊断消化道肿瘤腹腔转移缺乏特异性〔10〕。

另有学者采用巢式RTPCR检测胃癌腹腔冲洗液CK19mRNA、CEAmRNA阳性率较高，分别为62.7%、52.2%，且与胃癌浆膜受侵、肿瘤侵犯深度和病期密切相关，与组织学分化无关，得到相反的结论〔11〕。

李涛等〔12〕应用组织芯片和免疫组化方法检测CK19在胃癌原发及转移癌中的表达，结果显示CK19在原发癌和转移癌间呈一致性表达。

近年来随着分子生物学的发展，RTPCR方法具有较高的灵敏性，它能够在106～107个正常细胞中发现1个肿瘤细胞，或从1g组织或1ml液体中检测出1个肿瘤细胞，使得早期检出ECC成为可能〔13〕。

　　CEA是消化道恶性肿瘤特异性标志物，是一种细胞表面分子，由柱状上皮细胞分泌且存在于胃肠道恶性肿瘤中。

因此，胃癌患者体液中CEA含量的检测已经成为比较成熟的辅助诊断指标。

与常规检测CEA蛋白表达水平的方法相比，RTPCR方法从基因水平检测，无疑是一种灵敏度和特异度更高的方法。

CK是上皮细胞骨架的组成成分，表达于正常上皮及上皮源性原发及其转移肿瘤细胞，CK至少有20种组分，其中CK19在胃肠道肿瘤中有较高的表达〔14，15〕。

且在原发灶及转移灶中表达一致。

因腹腔内间皮及间叶细胞不表达CEA及CK19，因此，腹腔内若存在CK19mRNA或CEAmRNA，说明腹腔内出现异位上皮细胞，因此可推断为腹腔游离癌细胞存在的可能。

巢式RT-PCR技术由于采用了2对以上的引物扩增目的片段，与普通RT-PCR相比，检测的敏感性和特异性都明显增加。

本实验表明在老年胃癌腹腔冲洗液中，CK19、CEAmRNA的表达与浆膜受累有关，与病理分期有关，与淋巴结转移有关，而与肿瘤分化程度无关。

CK19、CEAmRNA的阳性表达情况与文献报道基本一致〔14，15〕。

CK19、CEAmRNA联合检测较单一检测可进一步提高敏感性，减少漏诊率。

随访至今，45例进展期老年胃癌病人中CK19、CEARTPCR均阴性的病人无一例腹腔内肿瘤复发，3例（细胞学检查、CK19、CEARTPCR均阳性的病人2例，细胞学检测阴性、CK19、CEARTPCR阳性的病人1例）8个月内腹腔内肿瘤复发（均经腹部CT证实），说明此方法有可能成为临床辅助诊断老年胃癌患者腹腔微转移的有效手段，其临床应用价值尚待更大样本进一步证实。

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