脂类细胞化学苏丹III染色法 山东大学.docx

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脂类细胞化学苏丹III染色法山东大学

脂类细胞化学——苏丹III染色法

【实验目的】

1.了解脂肪染色的原理、操作步骤及脂类标本制片原理。

【实验原理】

脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等，脂肪依其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、髓磷脂以及其他类脂质。

通常，各种脂与类脂质在体内不是单独存在，是已某种程度混合存在。

脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。

很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。

脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。

如果组织中脂肪过多，将会影响其正常功能。

如脂肪肝。

脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。

其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。

脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。

苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。

苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。

脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。

60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。

丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。

用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。

常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。

用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：

冰冻切片

明胶包埋冰冻切片

铺片法

【脂质染色原理】

1、染料溶于脂类而使脂类显色。

2、使用时注意选择溶剂，要求既要溶解（苏丹）染料，又不溶掉脂类。

【实验用品】

1.材料

小鼠

2.试剂

苏丹Ⅲ染液：

将0.15克苏丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中（各50ml），充分摇匀，放入冰箱保存，由于苏丹Ⅲ难溶，需每天拿出进行摇匀，几天即可。

临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。

70%乙醇溶液

甲醛钙

3．器材

解剖针、载玻片、盖玻片、显微镜、镊子、剪刀。

【操作步骤】

1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，反扣于已滴加甲醛钙的载玻片上，固定20分钟。

2.吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。

3.用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。

4.用苏丹Ⅲ染色30分钟

5.吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。

【实验结果】

低倍镜高倍镜

【实验结果分析与注意事项】

1.根据结果可以看出，在高倍镜下细胞重叠现象较明显，其中可能是由于所取小鼠的肠系膜过厚，导致单个细胞的染色效果不明显。

另外，显微镜的质量亦会影响观察的效果。

2.解剖小鼠取得肠系膜时，由于肠系膜很容易破损，因此在操作过程中，动作要谨慎、小心一些，以免破坏肠系膜。

我们组一共取了三部分肠系膜，最后只有这一组观察到相对较好的结果。

取材也是一个重要的环境。

补充知识：

石蜡切片制备基本步骤

一、准备工作

（一）

（一）洗涤实验所需器皿：

（玻璃器皿的清洗）

1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷

2、将器皿在自来水下冲洗干净

3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干

注：

一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。

（二）配制：

硫酸洗液的配制

清洁液（洗液）的配制：

成分强酸液次强酸液弱酸液

浓硫酸（ml）1000200100

重铬酸钾（mg）63120100

蒸馏水（ml）2002001000

重铬酸钾1200g

蒸馏水2000ml

将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌

（三）载玻片与盖玻片的处理

1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时

2.流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍

3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用

注：

在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。

二、准备工作

（二）常用液体的配制

（一）缓冲溶液：

1．磷酸盐缓冲液

A液：

0.1mol/L磷酸二氢钠

B液：

0.1mol/L磷酸氢二钠

A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：

7≈PH7.0）

2．枸椽酸缓冲溶液

A液：

0.1mol/L枸椽酸

B液：

0.1mol/L枸椽酸钠

A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：

42.8≈PH6.2）

（二）固定剂：

1．甲醛：

10%甲醛福尔马林100ml

蒸馏水900ml

注：

实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液

甲醛液10ml

蒸馏水90ml

加碳酸钙至过饱和（以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度）充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：

8%多聚甲醛

多聚甲醛8g

蒸馏水100ml

加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。

滴加1NNaOH，并不停搅动至液体清明。

1NNaOH

lN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量

氧化钠（NaOH）；分子量＝40．005，当量价＝1

1NNa0H的配制方法为：

m＝40．005／1＝40．005g。

取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中

4%多聚甲醛

8%多聚甲醛50ml

0.1M磷酸盐缓冲液50ml

PH7.2

先取50ml8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.2

4．Bouin液：

苦味酸饱和水溶液75ml

36％~40％福尔马林液25ml

冰醋酸5m1

5．改良Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液45ml

95%酒精45ml

36％~40％福尔马林液5ml

冰醋酸5m1

6．Carnoy液：

冰醋酸10m1

氯仿30m1

无水乙醇60m1

以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。

24小时后固定液失效。

（三）染色液

1．Harris苏木精液

A液：

苏木精1g

无水酒精10ml

B液：

铵矾或钾矾20g

蒸馏水200ml

氧化汞0.5ml

冰醋酸8ml

将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。

全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96ml中加4ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。

此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。

由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。

2．Mayer苏木精掖

苏木精1g

钾矾或铵矾50g

碘酸钠0.2g

蒸馏水1000ml

水合氯醛50g

枸橼酸1g

将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。

再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。

如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。

核染色鲜明，染色时间5—10分钟。

用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。

3．Hasnsen甲矾苏木精的配制

A液：

苏木精1g

无水乙醇10ml

B液：

钾矾20g

蒸馏水200ml

C液：

高锰酸钾1g

蒸馏水16ml

三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。

4．伊红

0.5~1%水溶液或酒精溶液。

1．水溶性伊红

伊红5~10g

蒸馏水1000ml

冰醋酸10滴

先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。

2．醇溶性伊红

伊红5~10g

70%~90%酒精1000ml

冰醋酸10滴

（四）其它

1．麻醉剂：

2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。

2．各级浓度酒精的配制

75%；85%；95%；100%酒精。

75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）

3．盐酸洒精

多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。

配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸（Hcl）。

用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。

4．碘酒

取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成

5．生理盐水

以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物

三、取材，固定

（一）实验动物的抓取及固定

1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法

要点：

（1）动作要轻缓；

（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。

2．实验家兔的抓取及固定方法

要点：

（1）随时抚摩其头部；

（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。

3．豚鼠的抓取及固定方法

要点：

先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。

（二）实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法

1．编号和标记方法

（1）染色法

标记溶液：

3%~5%苦味酸黄色

2%硝酸银咖啡色（涂后光照10分钟）

0.5%中性红或品红红色

龙胆紫紫色

编号原则：

先左后右，从前到后

左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。

超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。

（2）挂牌法

（3）耳孔法

一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。

2．实验动物的随机分组方法

动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。

3．实验动物被毛去除方法

剪毛法

拔毛法

剃毛法

脱毛法：

系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。

方法：

将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。

然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。

脱毛剂配方：

（1）硫化钠3g

肥皂粉1g

淀粉7g

加水适量调成糊状

（2）硫化钠8g

溶于100ml水中

（3）硫化钠8g

淀粉7g

糖4g

甘油5g

硼砂1g

加水75ml

（三）实验动物处死

处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。

热爱生命，珍爱动物。

1．空气栓塞致死法

要点：

（1）常用于大的动物（如：

兔、猫、狗和猴等）；

（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。

2．麻醉后处死法

注：

采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。

（1）吸入麻醉法

要点：

（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；

（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火

（2）注射麻醉法

要点：

（1）适用范围较广；

（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。

3．脑、脊破坏法

要点：

（1）常用于蛙类；

（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。

4．断头处死法

要点：

（1）常用于小动物；

（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。

5．断椎法

要点：

（1）常用于大白鼠和小白鼠；

（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。

（四）实验动物解剖

解剖步骤

1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；

2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；

3．打开腹腔：

沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；

4．打开胸腔：

用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。

然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。

（五）取材

取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。

取材方法和注意事项

（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。

（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）

（3）取材的先后顺序原则。

根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。

先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。

（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。

（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。

（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。

（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。

（8）取材要尽量注意脏器的完整性。

（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。

对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。

（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。

（六）固定

1．固定的目的

（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；

（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；

（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。

（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。

2．固定的对象和方法

（1）固定的主要对象是蛋白质；

（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：

20）。

对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。

（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：

某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。

①局部灌注固定：

肺：

肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。

注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。

肝、肾：

经肝动脉或肾动脉注入固定液。

脑：

动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。

②全身灌注固定：

步骤：

取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。

待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）

3．固定液的性质和条件

（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。

（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。

（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。

（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。

（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。

4．固定时应注意的事项

（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；

（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；

（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；

（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；

（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；

（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液

（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。

5．固定剂

单纯固定剂

（1）10%甲醛：

对组织渗透性强，固定均匀。

对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。

能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。

经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。

（2）4%多聚甲醛：

对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。

固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。

（3）饱和的苦味酸溶液：

能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。

（4）冰醋酸：

渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。

（5）锇酸：

价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。

不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。

混合固定剂

（1）Bouin氏固定液：

为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。

一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。

（2）Zenker液（PH2.3）：

此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要12~36小时，加热可以缩短固定时间。

固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。

（3）Carnoy液：

渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。

显示DNA、RNA效果良好。

（4）改良Bouin氏固定液：

此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。

（七）组织块修整

固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。

经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。

修整组织块时，手术切片一定要锋利。

四、水洗

1．目的：

洗去渗入组织中的固定液，终止固定。

以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。

2．原则和方法：

固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。

（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。

（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。

（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。

（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。

（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。

（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内

五、脱水包埋

（一）脱水

1．脱水的目的

组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。

脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。

2．脱水剂

（1）乙醇：

可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。

高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。

（2）丙酮：

脱水能力比酒精强，但对组织的收缩更大，在组织学制片中较少使用，多用于病理快速切片，或用于某些组化水解酶的固定。

（3）正丁醇：

是较好的脱水兼透明剂，可与酒精及石蜡混合，用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，进行石蜡包埋时，可先用正丁醇和石蜡等量混合液，然后浸入纯石蜡包埋，正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脱水剂，但由于价格较贵，不常使用。

3．步骤

（1）乙醇脱水过程

50%乙醇6~8小时

75%乙醇6~8小时

85%乙醇3~5小时

95%乙醇1~2小时

95%乙醇1~2小时

100%乙醇Ⅰ1小时

100%乙醇Ⅱ1小时

（2）丙酮脱水

如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。

其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。

（3）正丁醇脱