微生物作程序.docx

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微生物作程序

标准化操作程序

一、标本接收筛选方案：

目测：

黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、稠厚，呈现团块状的标本为合格标本；

而无色透明、有灰白片状物或黑色小点，有明显食物渣滓、纸屑灰尘的为不合格标本。

显微镜下筛选：

对经过目测筛选的标本，在洗涤前还须再经过显微镜下筛选：

取约0.1ml痰液（黄豆大小）用接种环均匀涂布成2×2cm2大小的涂膜，在显微镜下，凡脓细胞>25/LP且鳞状上皮<10/LP的标本为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞<10/LP但细菌数量>+++或鳞状上皮>25/LP的标本为不合格标本，应拒收。

1、标本预处理：

采用先用20ml生理盐水洗涤两次，经过10ml生理盐水稀释后，加入1%的PH7.6的胰蛋白酶溶液消化90min后接种。

并同时在洗涤后制作原始痰涂片，进行染色镜检。

2.读片：

根据人体对细菌/真菌感染在早期主要以非特异性免疫的细胞免疫为主的特点，结合呼吸系统生理病理特点，阐述痰液形成过程和排出过程，我们可以得知，在下呼吸道中感染中形成的炎性渗出、包裹物中存在与感染直接相关的病原菌，在自然排痰的过程中会被上呼吸道的正常菌群所污染，但污染菌位于炎性包裹物之外，且人体对正常菌群具有共生性保护因而不会产生吞噬现象，借此理论，我们将选择痰标本中脓细胞成团块状分布，集中而不稠密，且周围无鳞状上皮细胞或无大量成团状分布的细菌球的区域为读片区，认真收寻20~30个视野中脓细胞聚集处的脓细胞胞浆中有无吞噬的细菌及细菌的染色排列特征，菌体特征（如粗细、长短、扭曲）并作记录，将此作为确定病原菌的理论依据。

二、标本的接种培养：

一般情况接种BA、Choc（含万古霉素50mg/L）、麦康凯/MecK（即“分科琼脂”NBIIA）、CHROMagar，BA、Choc置5%CO2、35℃潮湿环境培养，麦康凯/MecK、CHROMagar置普通环境35℃培养；怀疑为军团菌的加种BCYE-а培养基，怀疑为百日咳的加种Boudet-Gengou培养基，怀疑为肺结核的加种罗-琼氏培养基或采用商品化专门的分枝杆菌培养基培养；怀疑为肺炎支原体感染的加种Hayflick双相培养基或采用免疫学及分子生物学方法检测，肺炎衣原体须用免疫学或分子生物学方法。

三、读碟：

（经过18~24h隔夜培养，但孪生球菌、营养缺陷链球菌以及分枝杆菌则需延长培养时间）

1、G+菌：

BA生长、Choc不生长、MecK不生长，革兰染色：

分G+co（革兰阳性球菌）,G+b（革兰阳性杆菌）

①G+co—依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分:

葡萄球菌：

淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，β/γ溶血，较湿润，除金黄色葡萄球菌外，一般不具有临床意义；

微球菌：

黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义；

链球菌：

白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血为溶血型链球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的宽大а溶血为肺炎链球菌，该菌是最常见的肺部感染病原菌，在社区获得性感染中有重要的地位；细如针尖，白色凸起а溶血的为草绿色链球菌，自然咯痰标本中的草绿色链球菌一般不具有临床意义；

肠球菌：

灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，较湿润，但一般不具有临床意义；

口腔球菌：

白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕迹。

该菌偶尔可引起肺部的严重感染，一般好发生于COPD病人和肺气肿病人；

孪生球菌：

白色、凸起细小菌落，β溶血，生长慢48h仅0.2~0.4mm，在含羊血的MH琼脂上不生长。

该菌是上呼吸道的正常菌群组成之一，一般不导致肺部感染；

②G+b—依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分：

棒状杆菌：

白色1.0-1.5mm左右大小，较干燥，不溶血/狭窄β溶血的为白喉或一般棒状杆菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为J-K棒状杆菌；灰白细小，β溶血的可能为假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌；除白喉杆菌外，假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌是罕见的咽喉部病源菌，棒状杆菌一般不导致肺部感染；

乳杆菌：

细小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，无临床意义；

芽孢杆菌：

灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异巨大，宽大β溶血。

延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，边缘呈放射状扩散，形成叶状、掌状、雪花状、齿轮状等，常常为痰培养的污染菌；

③BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：

G+co

平面球菌、藻球菌：

血琼脂上为а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈现金属色泽，无临床意义。

2、G-菌：

根据形态分为G-b（革兰阴性杆菌）、G-co（革兰阴性球菌）、以及根据对特殊营养的需求对苛养性G-b进一步分类，常见的如嗜血杆菌，军团菌等：

①BA生长、Choc生长、MecK生长，——Gram染色：

G-b—氧化酶、分科琼脂颜色

肠杆菌：

氧化酶（-），分科琼脂上黄色湿润大菌落；

弧菌：

氧化酶（+），分科琼脂上淡黄色扁平大菌落；

非发酵菌：

氧化酶（+/-），分科琼脂上蓝色/无色透明小菌落—鲍曼不动杆菌为中等大小，菌落聚集处产不扩散黄色色素，分离菌落为兰色；

②BA生长、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：

G-co—氧化酶（+）、触酶（+）

奈瑟菌：

白色/黄色中等大小菌落，该类细菌为口腔常见正常菌群，该菌在痰培养中含量的高低反应了标本采集状态的合格程度，大量出现提示培养结果将是不可信的；

卡他莫拉菌：

白色小菌落（24h内），菌落有脆性，用接种环推之可移，是儿科和老年病人常见的下呼吸道病原菌；

③BA不生长/细小、Choc生长、MecK不生长，——Gram染色：

G-b、菌体细小或呈扭曲之长丝状

嗜血杆菌：

灰色/无色，半透明，1.5-2.0mm的多为流感嗜血杆菌，该菌为最常见的肺部感染病原菌，可发生于各个年龄层次，其高携带与COPD发病有较强的相关性；灰色略黄，不透明，1.0-1.5mm的多为副流感嗜血杆菌。

一般副流感嗜血杆菌不导致肺部感染，大量出现提示培养结果将是不可信的；

④BA不生长、Choc不生长、MecK不生长、BCYE-а生长/或在含有L-半胱氨酸、铁离子、复合抗生素选择剂的强化血琼脂上生长—Gram染色：

G-b、菌体细、长丝状

提示可能为军团菌：

该菌在BCYE-а上48~72h为中等大小扁平菌落，灰白色，较粘着；该菌具有较强的生物危险性，其中嗜肺军团菌可传染；

真菌及奴卡菌：

BA、Choc、分科琼脂、CHROMagar均生长—Gram染色形态、生长速度

真菌：

酵母样真菌，菌落中等大小，生长快，多数可在CHROMagar上显色；大多为口腔咽喉正常菌群，一般不导致肺部感染，但免疫缺陷、糖皮质激素、长期大剂量的抗生素使用可增加该类微生物机会感染的可能性；

烟曲霉菌，丝状真菌菌落，35℃培养24~48h时菌落为白色泛绿，72h后菌落迅速转为褐色，中心粉末状背面为黄褐色如烟熏状，该菌为肺部最常见的条件致病菌，感染时患者症状重，预后非常差；

奴卡菌：

小菌落，生长慢，菌落皱褶，呈颗粒状，有时产生褐色、黄色、黑色等色素，该类细菌可导致肺脓肿，标本脓性，有硫磺颗粒者应高度怀疑该菌；

3.肺炎支原体：

固体培养基上，低倍镜或解剖显微镜下为典型“荷包蛋”样菌落，在Hayflick双相培养基的液体中使培养基变黄，该类微生物是最常见的非典型性肺炎的病原体，在社区获得性感染中有着很高的比例。

四、细菌鉴定：

在痰标本的直接涂片镜检结果的指导下进行分离鉴定，必要时进行纯培养，再根据该细菌在各种不同培养基上的生长情况及相应菌落特征进行初步鉴定和分群，随后在细菌革兰氏染色镜检特点、触酶、氧化酶等简单试验的进一步鉴定和分群到相关的科或属后采用相应的编码鉴定系统鉴定手工或自动化鉴定，对溶血性链球菌及肺炎链球菌在生化反应的同时采用乳胶试剂作为补充。

5、药敏试验：

六、结果报告：

　　常规痰培养报告应包括完整的病人信息、临床诊断、抗生素使用情况（由临床医生在申请单上注明）、未染色标本直接涂片结果（有无脓细胞、脓细胞数量、上皮细胞数量、二者比例、有无真菌孢子／菌丝、有无寄生虫等）、Gram染色镜检结果（包括脓细胞数量、上皮细胞与胞外正常菌群数量与污染程度、脓细胞胞内吞噬细菌／真菌孢子的情况，炎性包裹物内细菌和真菌的存在情况、脓细胞和炎性包裹物内的细菌／真菌的染色特征、形态特征和排列特征）、所分离细菌的鉴定结果、耐药监测结果、一般药敏结果、该检验结果与临床诊断和治疗相关性的评述和建议。

七、质量控制：

为保证细菌学检验结果的快速准确和临床符合率，应对全过程进行严格的质量控制。

痰标本细菌学检验质量控制包括二大部分：

1、标本的质量控制：

主要包括向临床医护人员讲授痰标本的正确性的采集方法、送检时限和注意事项，不定时的到临床调查标准化采集的执行情况，定期反馈统计信息；坚持对所送标本进行外观和镜下的初筛；坚持标本的直接涂片镜检（包括不染色标本的高倍/低倍镜湿片镜检、10%KOH透明后镜检、革兰染色后的油镜镜检）。

2、检验过程的质量控制，这部分又包括了以下方面和步骤：

①培养基质量控制：

主要是各种首代分离培养基的效果控制：

包括不同培养基配制过程的标准化、质控菌株生长情况控制（应包括GI指数测定、菌落特征典型程度、而选择性培养基还应监控抑菌选择效果、菌落显色培养基还应观察菌落显色是否灵敏和鲜明），以及培养基从临床标本中分离出目的菌能力的测定。

②鉴定水平质量控制：

主要是采用典型质控菌株对生化反应培养基、鉴定卡和微量生化管等试剂进行定期测试：

测试项目：

典型阴阳性反应、灵敏度、鉴定符合率和重复性。

另外还应对技术人员的技术水平的进行不间断的再培训和不定期测试。

③药敏试验质量控制：

包括对MH培养基、药敏纸片或MIC卡的质量控制，方法参照CLSI相关规定。

对于MRS、ESBL、HLAR、AMPC、金属β-内酰胺酶等特殊耐药表型应坚持在18小时观察后继续培养至24小时或48小时（MRS）后复查一次。

另外，在药敏试验的同时还应用接种环挑取一环菌液作划线接种，可对所配菌液进行纯培养的验证，并可同时监控菌液浓度。

④采用全程质控观点对标本进行控制：

采用标本直接涂片镜检结果推断病原菌，指导分离鉴定方向；采用细菌培养特征（营养要求高低、不同选择选择性培养基生长情况及菌落特征）指导鉴定及对鉴定结果进行核查；采用鉴定结果对药敏结果进行控制或采用药敏的特殊谱型对鉴定结果进行控制（即利用已知菌对某种药物的天然耐药或天然敏感特征）[21-22]；采用对临床病历的抽样调查观察临床治疗效果，借以反馈检验结果与临床的符合率。

一、标本采集与验收

对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。

痰液是临床微生物学检验最常见的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。

（一）标本采集方法

1．自然咳痰法以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。

尽可能在用抗菌药物之前采集标本。

用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应≥1ml。

咳痰困难者可用雾化吸入加温至45℃的100g/LNaCl水溶液，使痰液易于排出。

对难于自然咳痰患者可用无菌吸痰管抽取气管深部分泌物。

标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存≤2h。

2．支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。

3．小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。

幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。

（二）标本验收与拒收

遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。

下呼吸道细菌学培养标本拒收标准

1、厌氧菌培养呼吸道有大量的正常菌群存在，咽试子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义。

2、标识错误申请单填写应完整。

标本标识必须唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部位或检验要求等拒收。

3、肉眼观察痰标本呈水样或唾液样，拒收。

4、标本涂片白细胞和鳞状白细胞数＜10/低倍镜和鳞状上皮细胞数＞25/低倍镜，

5、上皮细胞计数表示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。

6、容器错误标本容器必须符合规定，溢漏、无盖者拒收。

7、运送错误送检时间超过2h拒收。

8、双份标本同时同部位或同一天两份相同检测的标本（应与申请医师协商处理）。

二、实验室检查

（一）肉眼观察观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能与放线菌属及奴卡菌属感染有关。

（二）显微镜检查下呼吸道细菌学检验的标本均需涂片革兰染色进行细胞学和细菌学显微镜检查，细胞学检查的目的是判别送检标本是否适合做细菌培养，判断标准见表3，近年来推荐简单的方法是痰标本涂片镜检＞10个白细胞/低倍镜时，就可判断是基本合格并可用于细菌培养的标本，尤其是白细胞减少的患者。

细菌学检查的目的是初步判定有否病原菌以及病原菌的数量和类别，有助于初步报告、选择培养基和对培养结果的综合分析。

表3下呼吸道细菌学检验标本涂片显微镜白细胞和鳞状上皮细胞计数判断标准

分类

细胞数/低倍镜

结果判断

白细胞

鳞状上皮细胞

A

＞25

＜10

合格可用于细菌培养

B

＞25

10~25

尚合格可用于细菌培养

C

＜10

＞25

不合格，重送标本

2．细菌涂片染色检查挑取少量痰液中脓性或带血标本在洁净的玻片涂成均匀薄片，革兰染色后镜检，油镜下观察细菌形态，排列和染色性，可初步推定菌属（或种），涂片中所见细菌的量及吞噬细胞内是否有细菌等。

如发现酵母样菌、菌丝、孢子和放线菌或奴卡菌等，应予相应报告和按要求做相应的检查。

（三）分离培养

1．痰标本培养前处理不含或含粘液很少的合格标本，可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂（如pH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35℃待充分液化再行接种。

亦可加液化剂后用旋转混匀器搅拌混匀，3000r/min离心10min弃上清液，取沉淀物接种。

2.分离培养

（1）一般细菌培养应同时划区接种：

1）血平板适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。

2）加抗生素的巧克力平板适用于分离嗜血杆菌。

3）麦康凯/中国兰平板适用于分离革兰阴性杆菌。

（2）分离培养血平板和巧克力平板置5%CO2环境，麦康凯平板/中国兰平板置普通孵箱，35℃孵育。

3.挑取可疑菌落进行细菌鉴定和药敏试验：

痰及下呼吸道分泌物标本易受到上呼吸道正常菌群的污染，临床微生物学实验室通常可从送检的呼吸道标本中分离出多种细菌，但分离细菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗感染性疾病至关重要。

实验室人员在检验过程中应重视判断所分离的细菌是污染的上呼吸道正常菌群还是引起下呼吸道感染的病原菌。

在实际工作中，有时也由于细菌生长速度不一，如肺炎链球菌可能被生长速度快的细菌（包括正常菌群）菌落掩盖，不仔细观察就会忽略检验。

当在同一培养基上分离出多种的病原菌（复合菌）时，应主动与临床医师联系，结合患者的临床症状、痰涂片染色镜检及近期细菌培养结果（如近期同一病人多次分离培养出同一种菌）等综合判断所分离的多种细菌中哪一种菌可能为致病菌（优势菌）。

当分离优势菌与涂片染色镜检结果相符时，优势菌必需进行药敏试验。

若分离培养结果与涂片染色镜检结果不相符时，或优势生长病原菌时，还需做药敏试验，但在报告中提示，此结果请结合临床和涂片所见进行分析。

三、痰及下呼吸道分泌物标本

1、肉眼观察及涂片革兰染色白细胞、鳞状上皮细胞和细菌学显微镜镜检

2、初步报告合格标本不合格标本

3、培养前处理：

血平板（5%CO2环境）巧克力平板（5%CO2环境）麦康凯/中国兰平板（需氧环境）

4、菌落观察，涂片染色镜检

①结合涂片白细胞、鳞状上皮细胞计数和细菌学镜检结果与培养结果综合分析

②细菌鉴定药敏试验

③结合涂片白细胞、鳞状上皮细胞计数和细菌学镜检与培养鉴定、药敏结果综合分析

④结果报告（最终报告）

四、结果报告

（一）下呼吸道标本细菌学检验结果报告由于检验结果报告的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果报告。

1.初步报告应包括标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告（发现有诊断价值时应及时向临床口头报告，并作相关纪录）；涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告

细菌学镜检的描述性报告：

如镜检见到排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形成矛头状端相背，成双排列，具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告“找到革兰阳性球菌，形似肺炎链球菌”；如见到不易识别的细菌时则报告“找到革兰×性×形细菌”；如检见其他有意义病原体亦应报告和做其他的检查

白细胞和鳞状上皮细胞计数的描述性报告：

包括白细胞和鳞状上皮细胞数/低倍镜、细胞内有否含有细菌和胞内细菌染色及形态学特性。

2.最终结果报告应包括送检标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、分离致病菌的鉴定结果、药敏试验结果。

（二）下呼吸道标本细菌学检验三种常见的结果报告形式：

1．痰标本涂片革兰染色后白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检未发现有临床诊断意义结果（可不用初步报告），细菌分离培养为正常菌群时，最终检验结果应报告“正常菌群”生长、并以“+”表示。

如标本为支气管采取分离菌为单一定植的正常细菌时，（大量或长期应用抗菌药物者），应报告“菌群失调”。

若无菌生长应报告经48小时培养无细菌生长，有意义的培养基（巧克力平板、血平板），再置2天仍无生长可弃之。

2．标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检发现有诊断价值时，细菌分离培养检出优势菌，并与涂片染色镜检结果相符时，除及时初步报告外，最终检验结果应报告标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、优势菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果等。

3．涂片与培养结果不一，但培养出“优势可疑病原菌”时，药敏试验还需做，并及时与临床联系，最终检验报告应报告标本肉眼观察结果，涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数，细菌学镜检的描述性报告，细菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果。

但提示此结果请结合临床和涂片所见进行分析。

五、实验操作方法

　1、　药敏片法

　①　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。

具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。

然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

（另：

可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。

要求涂布均匀致密）

　②将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。

为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。

为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

　③将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　2、牛津杯法

　　①在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。

具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。

然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

（另：

可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。

要求涂布均匀致密。

）

　　②以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。

每个平板可放4-6支小管。

待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。

置37℃培养8-18小时，观察结果。

　　③将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　3、打孔法：

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

　①在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。

具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。

然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

（另：

可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。

要求涂布均匀致密。

）

　②以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

③加样：

按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

　④将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

药敏试验-结果观察

　　在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。

过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。

其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

药敏试验-判定标准

抑菌圈直径（毫米）

敏感度

20以上

极敏

15~20

高敏

10~14

中敏

10以下

低敏

0

不敏

1、药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

　　二、药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

药敏试验-影响药敏结果的因素

　　一、培养基：

应根据试验菌的营养需要进行配制。

倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。

培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

　　二、细菌接种量：

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活

　　三、药物浓度：

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。

商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

　　四、培养时间：

一般培养温度和时间为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

药敏试验方法：

K-B法：

1从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。

2在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。

3用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保