最新基因工程原理复习资料.docx
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最新基因工程原理复习资料
0、基因工程的技术基础和理论基础
1）理论基础：
40年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，明确了物质基础
50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递
60年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。
2）技术基础：
60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，用于DNA分离和检测
60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割
70年代中期，实现DNA分子的核苷酸序列分析技术
80年代实现体外重组DNA并进入宿主细胞
1、基因工程研究的主要内容或步骤
1从生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；
2在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组DNA分子；
3将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；
4从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；
5从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；
6将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要物质。
2、三位一体的基因概念
1基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。
2基因是染色体上的实体
3基因象链珠（bead）一样，孤立地呈线状地排列在染色体上
基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。
3、一位一体的基因概念
基因是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。
基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。
4、顺反子假说
1个顺反子决定1条多肽链。
能产生1条多肽链的是1个顺反子，Cistron是基因的同义词。
在一个顺反子内，有若干个突变单位：
突变子（muton）。
在一个顺反子内，有若干个交换单位：
交换子（recon）。
5、全同等位基因
在同一基因座位（locus）中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因（homoallele）。
6、非全同等位基因
在同一基因座位（locus）中，不同突变位点（site）发生突变所形成的等位基因（heteroallele）。
7、重叠基因的概念及其生物学意义
概念：
大多数由一条DNA序列组成的基因，仅有编码一种蛋白质的功能（尽管基因在两端有非编码区，并且在编码区内有内含子）。
但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。
生物学意义：
a）原核生物进化的经济原则（较小的C值编码较多的基因信息）；
b）提高蛋白质的疏水性,以增强生物体自然选择的适应性。
8、重复基因的概念及其生物学意义
概念：
在染色体组上存在多份拷贝的基因。
重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。
生物学意义：
a）含有遗传调控信息:
一些基因呈高度重复排列，如核糖体ｒＲＮＡ基因。
这些基因的重复排列方式可以快速、大量地表达出蛋白产物，从而满足机体的需要；调控基因复制、转录、翻译。
核酸碱基的错配更正，损伤修复，也受重复序列的影响。
重复序列还可以形成核酸的高级构象，进而进行各种表观遗传修饰。
b）促使核酸包装成各种高级结构:
重复序列能够特异性地结合一些蛋白质，从而使核酸序列形成二级、三级甚至更高级结构。
c）通过染色体的异染色质化而关闭基因的表达
d）维持重要基因的正常结构，保证生命活动的正常进行：
大量的重复序列保持重要的编码基因相对稳定，这才能维持正常的生命活动；
e）为遗传变异和新基因的生成提供了空间，产生进化的动力：
新变异或者新基因经常出现在容易发生突变与重组的重复区域，既不会破坏原来的遗传信息，又可以提供突变进行的场所，产生新性状。
9、断裂基因的概念及其生物学意义
概念：
真核生物的结构基因是由若干exon和intron相间隔排列的序列组成的间隔基因（断裂基因）。
a）Intron并非“含而不露”；
b）Exon并非“表里如一”；
c）并非真核生物所有的结构基因均为splittinggene。
生物学意义：
a）有利于遗传的相对稳定:
即使错误剪接留下的intron部分,被mRNA监测系统降解,避免病变和死亡；
b）增加变异机率，有利于生物的进化：
内含子增加了基因的长度，增加了基因内的重组交换几率，有利于形成变异和生物多样性；
c）扩大生物体的遗传信息储量：
对Exon和intron不同方式的剪接（选择性剪接），形成不同的基因产物；
d）通过改变读码框架，利用intron编码基因。
10、跳跃基因的概念及其生物学意义
概念：
跳跃基因也叫做转座子，是一些能够从一个染色体位置转移到另外的位置的DNA序列。
跳跃基因在生物体中广泛存在。
生物学意义：
转座子对基因而言是一个不稳定因素，他可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且在基因组中成为可移动的同源区。
产生新的变异，有利于进化。
目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。
此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高
11、假基因
在演化过程中，很多基因经过了复制，其中的一个版本积累了使其失去功能的突变。
1与正常基因结构相似但丧失正常功能的DNA序列；
2假基因都是在真核生物的基因组中发现的，在原核生物中未见报道;
3假基因由活化的原始基因突变而来，这是因为存在着在某个阶段伤及基因表达的一种或多种缺陷（如启动子错误、有缺陷的剪接信号、框架中有终止信号等）之故;
4大多数基因家族都有一些成员是假基因。
12、模糊基因
RNA编辑造成了mRNA的密码子的大部分，使它们从无意义信使成为有意义的信使,它们原来的基因的A序列只不过是一串简略的意义模糊的序列（abreviateorcrypticgene），这一串简略的意义模糊的序列称为隐秘基因或模糊基因（cryptogene）。
模糊基因在病毒、原生动物、哺乳动物与植物中广泛存在。
13、表观遗传修饰的方式
①DNA分子的特定碱基的结构修饰（如胞嘧啶的甲基化）；
②染色质构型重塑（chromatinremodeling）（如组蛋白的构型变化）：
组成核小体的组蛋白可以被多种化学加合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。
a）组蛋白不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质和有表达活性的基因相关联；
b）组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置；
③基因组印记:
生物体中约有1%的基因并不按照孟德尔规律遗传，而是只表达来源于双亲中的某一单亲的基因,这种现象称为基因组印迹，那个被掩盖了的基因叫做被印迹的基因。
DNA甲基化是“imprint”的重要机制；
④PTGS（RNAi）。
14、从基因概念的发展说明C值矛盾形成的原因
一个物种的单倍体的染色体的数目称为该物种的基因组。
单倍体基因组总DNA的含量的称为最大C值；编码基因信息的总DNA含量称为最小C值。
C值悖论:
1生物体进化程度高低与大C值不成明显正相关。
一些植物和两栖类动物，它们的DNA含量高达1010－1011bp，而人类DNA含量仅为109bp；
2亲缘关系相近的生物大C值相差较大；
3一种生物内大C值与小C值相差极大。
原因：
真核生物基因组中存在大量的不编码基因产物的DNA序列，一般而言，越是简单的生物基因组不编码蛋白质的DNA序列越少，它们的结构基因的数目越接近DNA含量所估计的基因数。
15、限制修饰系统
限制修饰系统（Restrictionmodificationsystem或R-M系统）是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
16、限制性内切酶的命名原则
宿主：
属名第一字母、种名头两个字母；菌株或型号；序号：
罗马字。
例如HindⅢ限制性内切酶：
Hin指来源于流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae），d表示来自菌株Rd，Ⅲ表示序号。
以前在限制性内切酶和修饰酶前加R或M，且菌株号和序号小写；
现在限制性内切酶名称中的R省略不写；Escherichiacoli。
17、限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子，分三类（I,II,III）
也有分四类，IIs类，即II亚类。
18、限制性内切酶识别的序列的特点
1）识别序列长度：
一般4-8，最常见为6；当识别序列为4个和6个碱基时，在可识别序列完全随机的情况下，平均256和4096个碱基出现一个识别位点。
2）识别序列的结构：
①多数为回文对称：
切割位点在DNA两条链相对称的位置；②少数限制酶的识别序列非对称；③多识别序列（简并序列）:
可识别多种序列；④间断对称:
有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。
3）切割位置:
①大多数内部；②一部分在两端；③还有一部分在两侧。
19、限制性内切酶产生的末端类型
1）匹配粘端（粘性末端）:
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），这样形成的两个末端相同，也是互补的；
2）平端（Bluntend）:
在回文对称轴上同时切割DNA的两条链；
3）非对称突出端:
①来自非对称识别序列，切割的DNA末端是不同的；②简并序列；③间隔序列：
间隔区域序列是任意的；
4）同裂酶（isoschizomer）:
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
①同序同切，识别位点和切割位置相同；②同序异切：
识别位点相同，但切割位点不同；③“同功多位”：
识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。
5）同尾酶:
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同且对称，既可以产生相同的粘性末端。
同尾酶切割DNA产生的末端可以进行互补连接。
20、位点偏爱产生的原因
某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。
原因：
（1）NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ三种酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶；
（2）BspMI、EcoRII、HpaII它们对要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点（allosteric）。
由顺式方式提供（cis）：
它们相互靠近或可形成环（loop），或由反式作用提供：
其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供；BspMI难以切割DNA：
在pBR322和pUC18/19中有一个BspMI位点，100倍的过量切割时/一半DNA未切割。
21、星星活性产生的原因
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关。
最普遍的活性变化是①1个碱基的变化；②识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口
引起星星活性的因素:
①高浓度甘油（>5%）；
②酶过量（>100U/μg）；
③低离子强度（<25mM）；
④高pH（>pH8.0）；
⑤有机溶剂（如DMSO，乙醇，乙二醇等）；
⑥用其它二价阳离子（Mn++，Cu++，Co++,Zn++）代替Mg++。
抑制星星活性的条件（措施）
①减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度；
②保证反应体系中无有机溶济或乙醇；
③提高离子强度到100～150mM（如果不会抑制的话）；
4降低反应pH至pH7.0；
⑤使用Mg++作为二价阳离子。
22、酶切反应条件（缓冲液、双酶切策略、反应温度等）
1）缓冲液：
①常规缓冲液：
pH：
通常7.0-7.9（at25℃），用Tris-HCl或乙酸调节；
Mg++：
作为酶的活性中心，由10mMMgCl2或MgAc调节，一般为10mmol/L；
DTT（二硫苏糖醇）1mM：
有抗氧化作用（强于巯基乙醇），保护酶分子上的还原性基团，稳定酶的活性；
BSA（bovineserumalbumin）（100g/ml）：
少数需要（BSA是酶的稳定剂，防止酶分解和非特异性吸附；BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些环境因素如加热,表面张力及化学因素引起的变性；BSA能防止酶吸附到管壁而损失）。
离子强度：
不同酶对离子强度的要求差异大，一般用NaCl来调节。
②通用缓冲体系:
one-Phor-Allbufferplus,OPA+（通用缓冲液）:
可以适用所有的限制酶，缓冲液包括100mmol/LTris-HCl,500mmol/L乙酸镁和100mmol/L乙酸钾；
不同酶使用的最佳浓度不同；常用浓度有0.5X，1X，1.5X，2X等。
③双酶切策略:
a）选用都合适的Buffer或通用缓冲液；
b）若找不到共用的缓冲液，可先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；
c）或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液。
2）反应温度:
大多数为37℃，一部分为50-65℃，少数25-30℃；高温作用酶在37℃时活性会下降，一般为最适条件的10-50%；一般销售产品说明中都会表明最佳温度。
3）反应时间:
1hrormore，许多酶延长其反应时间可减少酶的用量。
4）反应终止:
①EDTA（通过螯合镁离子），终10mM；②加热:
37℃酶65℃或80℃处理；80℃处理20min仍失活的酶，可以用苯酚去除蛋白。
23、酶切位点的引入方法
1）产生的5’突出端补平后连接:
将产生的5'突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。
2）同尾末端的连接:
不同的同尾酶切割DNA产生的末端在相互连接时，可以产生新的酶切位点，同时原先的酶切位点消失。
3）平端连接。
24、甲基化酶概念和类型
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
在E.coli中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶。
在真核和原核生物中存在大量甲基化酶。
1）Dam甲基化酶：
GATC腺嘌呤N6位置引入甲基；有些限制酶对Dam甲基化敏感，不能切割相应的序列，如BclI,ClaI,MboI,XbaI等；不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等。
一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化；当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA。
2）Dcm甲基化酶：
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上C5位置上引入甲基。
3）EcoKI甲基化酶：
识别AAC（N）6GTGC；TTG（N）6CACG序列中AN6位置；但识别位点少（1/8kb）研究较少。
4）SssI甲基化酶：
来自原核生物Spiroplasma，CG序列中的C在C5位置上甲基化，可在未甲基化或半甲基化链上起作用。
许多酶对此甲基化敏感。
25、甲基化对限制酶切的影响
1）修饰酶切位点：
①HincII：
GTCGAC，GTCAAC，GTTGAC，GTTAAC；②BamHIGGATCC；M.MspI：
m5CCGG；如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割。
③构建DNA文库时用AluI（AG↓CT）和HaeIII（GG↓CC）部分消化基因组DNA；用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割。
2）产生新酶切位点；
3）用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布；
4）对基因组作图的影响:
在哺乳动物DNA中：
CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5；含CpG序列的识别序列极其稀少；大多数CpG都发生甲基化；含CpG的所有识别序列的酶不能切割。
26、常见DNA聚合酶类型及特点
真核细胞有4种DNApoly
α：
位于细胞核内，催化细胞增生；
β：
小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺中提取，与细胞增生无关；
γ：
100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高；
其它：
线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA合成。
原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关
I．单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长
II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关
III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶
1）大肠杆菌DNA聚合酶I（EcoliDNApolymeraseI）：
①活性：
单链多肽（109kDa），有三种活性。
a）5’→3’DNA聚合酶活性。
底物:
模板（ssDNA）,引物（带3‘OH基）或5’突出DsDNA；
b）5’→3’外切核酸酶活性。
底物:
dsDNAorDNA:
RNA杂交体；从5’端降解dsDNA，也降解RNA:
DNA中的RNA（RNaseH活性）；
c）3’→5’外切酶活性（proofreading）:
底物：
3’-OHdsDNAorssDNA;从3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封闭。
②用途：
a）切口平移法标记DNA：
（所有DNApoly中只有此有此活性）产生切口，外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移；若有放射性dNTP,则可标记成探针。
b）用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性，但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶。
c）末端标记（交换或置换反应）：
T4DNApoly、T7DNApoly更好。
2）Klenow酶：
Klenowfragment：
将大肠杆菌DNApolyI在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。
①活性，共两种,同DNApolyI。
②作用：
a）补平3’凹端，注意要用dNTP，如果使用带标记的dNTP，可对末端进行标记；
b）抹平3’凸端，注意必须加足量dNTP；T4和T7具更强3’--5’外切活性，被取代
c）末端标记：
A．置换反应同前,同样被T4poly代替；B．补平3’--凹端的过程进行标记。
d）cDNA克隆中合成第二链
e）随机引物标记
f）DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。
g）PCR反应被Taq等取代
h）在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA
3）T4噬菌体DNA聚合酶:
①活性与Klenow酶相似，但3’—5’外切活性强200倍；
②用途：
a）补平或标记3’凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记）
b）置换反应:
必须有高浓度dNTP（一种）末端标记
c）标记DNA片段：
即利用外切活性产生了3’凹端，再补平（用标记的dNTP）
4）T7噬菌体DNA聚合酶:
来源于T7phage感染的E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体（基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白）
①活性：
T7DNApoly为持续合成能力最强的一个，平均长度要大得多,在测序时具有优势；
活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似，但3’→5’外切活性是Klenow的1000倍
②用途:
a）替代T4的功能
b）长模板的引物延伸
c）修饰的T7DNApolymerase用于测序反应（测序酶）SequenaseUSBBiochemical.99%3’—5’外切活性被除去.
5）耐热DNA聚合酶
6）反转录酶Reversetranscriptase:
依赖于RNA的DNA聚合酶,具有5’→3’合成DNA活性；无3’→5’外切酶活性。
①种类
a）来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）。
二链多肽（62kDa/94kDa）；具5’→3’DNA聚合活性；具很强的RNA酶H活性（降解与DNA杂交的RNA）；在反应开始时，引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争；终止时，RNaseH可在正在增长的DNA链近3’端切割模板，趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度；
b）Mo-MLV（M-MuLV）：
Moloney鼠白血病病毒。
单肽84kDaRNaseH活性弱，利于合成较长cDNA；纯度高、工程产品，42℃失活。
②用途
a）cDNA克隆中第一链的合成
b）测转录起始点（引物延伸法）
c）5’突出DNA的补平
d）测序反应（当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时）
e）其它RT-PCRRNA二级结构
③活性
a）5’→3’DNA聚合活性（Mg++）:
RNAorDNA模板及带3’OH的RNA或DNA引物
b）RNaseH活性
④注意事项
a）无3’→5’外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。
b）为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。
c）单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低）,50放线菌毒D，抑制第二链合成。
7）末端转移酶:
来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly,是不依赖模板的DNA聚合酶;在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。
①底物
DNA,可短至3个核苷酸,对3’突出的末端底物效率最高；
低离子强度时,平端或3’凹出端DNA亦可，但效率低；
②用途
a）在3’端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记
b）末端标记ddNTP（标记的）
27、Weiss单位和NEB单位
Weiss单位：
在37℃下20min催化1nmol32p从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需的酶量。
NEB单位（NewEnglandBiolabs）:
通过粘性末端的连接效率来表示。
即，在20μl反应体系中于16℃，使HindⅢ切过的λDNA（300μg/ml，0.12μM5'末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。
1Weiss=67粘端连接单位（NEB单位）。
1NEB单位=0.015Weiss单位。
28、载体
由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面，而进行复制。
29、作为基因克隆载体的条件
1）容量：
分子较小，可携带比较大的DNA片段；
2）（复制：
能独立于染色体而进行自主高效的复制；
3）酶切位点：
有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）；
4）标记：
有适合的标记，易于选择；
5）安全性：
要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
6）表达：
有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；
30、质粒载体必须具备的基本条件并列举2-3种质粒载体特点
质粒载体必须具备的基本条件
1）具有复制起点：
自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。
2）具有抗菌素抗性：
理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
3）具有若干限制酶切单一位点多克隆位点（multiplecloningsite，MCS）；
4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低。
pSC101质粒载体:
严谨型复制控制的低拷贝数大肠杆菌质粒载体，每个寄主细胞
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