地高辛试剂盒使用说明1.docx
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地高辛试剂盒使用说明1
仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用
只能在体外使用
地高辛DNA标记和检测试剂盒1
和NBT/BCIP一起用于颜色检测
通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测
货号：
11745832910
此试剂盒储存条件-15oC—-25oC
此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应
可检测100cm2面积的杂交膜24张
指导手册
2009.11版
1前言
1.1内容表
1前言.........................................................................................................................................2
1.1内容表..................................................................................................................................2
1.2试剂盒内容..........................................................................................................................3
2简介.........................................................................................................................................5
2.1产品概述..............................................................................................................................5
3步骤和所需材料.....................................................................................................................8
3.1开始之前..............................................................................................................................8
3.2地高辛DNA标记................................................................................................................9
3.3标记效率的测定...............................................................................................................11
3.4DNA的转移和固定.........................................................................................................14
3.5杂交....................................................................................................................................16
3.6免疫检测............................................................................................................................18
3.7DNA印记的洗脱和再杂交..............................................................................................20
4结果.......................................................................................................................................21
4.1典型的结果........................................................................................................................21
5附录.......................................................................................................................................23
5.1故障排除............................................................................................................................23
5.2引用....................................................................................................................................24
5.3订购信息............................................................................................................................25
1.2试剂盒内容
瓶/杯号
标签
内容包括功能
1
地高辛高效引物
1.50ul地高辛高效引物
2.5×标记的混合物的浓度，包括随机引物，核苷酸，DIG-dUTP（碱标记的），Klenow酶和缓冲液混合的最佳浓度。
3.随时可用
4.澄清的粘液
5.用于DNA的高效随机引物标记
2
DIG标记的对照DNA
20ul
（5ug/ml）PBR328DNA（用BamHI线性化）
澄清溶液
用于确定标记效率
3
DNA稀释缓冲液
3×1ml
（50ug/ml鱼精DNA在10mMTris-HC中，1mMEDTA;在25oCpH8.0）
澄清溶液
4
抗地高辛的碱性磷酸酶结合物
100ul
（750U/ml）
从羊，Fab段，结合碱性磷酸酶中获取的
澄清溶液
5
NBT/BCIP
6×1ml
50×浓度的原溶液（即67%（v/v）的DMSO中含有18.75mg/ml硝基氯化四氮唑蓝和9.4mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐
可以在浅黄色和棕色之间变化，澄清溶液
与碱性磷酸酶反应
6
封闭液
4×100ml
10×浓度
黄色，粘液
7
地高辛杂交颗粒
准备4×100ml（为17页做准备）
杂交液
附加仪器与所需试剂
除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
在每个操作程序的前面提供了详细的信息
操作程序
仪器设备
试剂
3.2DIG-DNA标记
水浴
灭菌的双蒸水
0.2MpH8.0灭菌的EDTA
3.3标记效率的半定量测定
带正电荷的尼龙膜*
地高辛洗涤和封组缓冲液组合*
TE缓冲液
或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
TE缓冲液
3.4DNA转移和固定
紫外光盒
或者商业化可用于紫外交联的其他设备
20×ssc
或者10×ssc
3.5杂交
尼龙膜，带正电荷*
杂交袋*
或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶
注意：
当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘
3.6免疫检测
容器大小与滤器大小相适应
杂交袋*
地高辛洗涤和封组缓冲液组合*
TE缓冲液
或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
TE缓冲液
3.8DNA斑点的脱色和重新标记探针
大的托盘
水浴
10×ssc
10%SDS
0.2MNaOH
*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得
2介绍
2.1产品概况
实验原则
此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析法用于杂交和后续的颜色检测
（1）
步骤
描述
DNA标记
根据随机引物标记技术采用地高辛标记的高效引物获得了地高辛标记的DNA探针。
地高辛标记的高效引物是一种专门生产的产物混合物，其中，含有地高辛dUTP，碱性标记（图2）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先优化的5×浓度反应缓冲液
杂交
根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。
采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交
免疫检测
杂交探针可以和抗地高辛的碱性磷酸酶结合物和Fab段进行免疫检测，然后采用比色底物NBT/BCIP可以看到杂交结果。
应用
地高辛标记DNA探针可以用于：
所有类型的滤膜杂交
总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行
检测，如人，大麦和小麦。
样品材料
至少100bp的DNA片段
线性的质粒，cos质粒或者λDNA
超螺旋的DNA
实验时间
此表格列出了每一步实验所需的反应时间
步骤
反应时间
DNA标记
1小时--O/N
杂交
6小时或者O/N
免疫检测
1.5小时
显色
0.5-16小时
检测数量
一个试剂盒足够用于：
不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应
和100cm2有24个斑点的检测
质量控制
根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。
试剂盒的储存和稳定性
未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15oC到-25oC（保质期印在标签上）。
在干冰中运输
一旦开封，请根据下表达选择适宜的储存条件。
试剂盒成分
储存条件
抗地高辛碱性磷酸酶结合物（4号管cap）
2-8oC稳定
封组液（6号管bottle）
未开封时15oC-25oC稳定
一旦开封，应分装并储存在-15oC到-25oC或者无菌条件下2-8oC间可以保存1个月。
工作溶液都应是新鲜配制的
NBT/BCIP（6号管cap）
2-8oC，稳定
或者在15-25oC，至少4周
注意：
在干冰中运输过程中，温度迅速升到37oC时，物质容易溶解从而导致沉淀产生
灵敏度和特异性
采用southern杂交从1ug消化胎盘DNA中检测到单拷贝人基因
注意：
灵敏度同时依据在杂交中标记的DNA浓度和颜色反应的时间
优点
此表描述了这个试剂盒的优点和特征
优点
特征
精确，快速
预先已混好的地高辛高效引物混合物减少了标记DNA时手动操作的时间，同时提高了产量，重复性好
灵敏
在复杂的整个的人DNA及植物基因组中能够检测到单拷贝基因
省时
地高辛标记的探针可以至少储存一年。
杂交溶液可以重复利用3-5次，重复次数主要取决于每次杂交中产生信号的标记探针的量
3实验步骤和所需材料
3.1在你开始前
主要的操作要求
此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示
要求
指引
在清洁的条件下进行操作
高效灭菌地高辛系统的试剂
过滤灭菌的溶液包括：
SDS，吐温20，并应该加入到已灭菌的溶液中
用干净的孵育托盘
每次使用前都要严格地清洗实验托盘
处理膜的要求
带无粉手套
处理膜的时候，只能用干净的镊子夹膜的边缘
流程图
3.2部分
地高辛标记DNA
3.3部分
标记效率的检测
3.4部分
DNA固定
3.5部分
杂交
3.6部分
免疫检测
3.7部分
DNA斑点的洗脱与重新标记探针
3.2地高辛标记DNA
介绍
随机引物标记的DNA带有地高辛--11--dUTP，这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，5乘浓度标记的混合物，其中，dNTP混合物包括碱性标记的地高辛--11--dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。
附加设备和所需试剂
水浴
冰水混合物
此表中列出了成分你，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途
溶液
成分
储存条件/稳定性
用途
水
高压灭菌的双蒸水
15-25OC，稳定
稀释DNA
EDTA
0.2MEDTAPH8.0
15-25OC，稳定
终止标记反应
模板DNA
下表中列出了模板DNA所需特征：
特征
详细信息
纯度
质粒DNA采用高纯质粒提取试剂盒进行净化。
当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进行一次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。
在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进行的。
大小
为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在100或者以上。
如果模板DNA大于5kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如HaeⅢ）对模板进行酶解
数量
根据上面步骤的描述，原则上10ng-3μg的模板均可以标记上，然而请仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针的数量。
可以根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。
如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板DNA用量至少300ng（探针浓度：
25ng/mL杂交液）。
标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA
如果你想要完成基因组的southern杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。
从凝胶中分离DNA片段，为获得更好的结果，可以用高效的PCR产物纯化试剂盒或者用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒来从凝胶中分离DNA。
步骤
此步骤用于标记10ng-3μgDNA。
可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10μg）。
步骤
操作
1
向一个反应管中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μl。
2
沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中
注意：
完全变性对于标记的有效性是十分重要的
3
完全混合地高辛高效引物（瓶1），加入4μl到变性的DNA中，混合并短暂离心
37℃孵育1小时或者过夜
注意：
较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产量
4
加入2μL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65℃加热10分钟终止反应
注意：
采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板的长度
标记反应的产量
表1：
此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。
在标准反应中每个实验采用1μgDNA作为模板。
1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。
20小时后消耗了大约38%约2μg的核苷酸。
模板DNA
1h
20h
10ng
45ng
600ng
30ng
130ng
1050ng
100ng
270ng
1500ng
300ng
450ng
2000ng
1000ng
850ng
2300ng
3000ng
1350ng
2650ng
使用地高辛高效引物溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。
地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。
3.4标记效率的确定
介绍
地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。
在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。
实验原则
检测标记探针质量的好方法是直接检测法。
步骤
描述
1
将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上；
尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（Vial2）作为标准。
2
采用anti-DIG-AP结合物（Vial4）和随时即用的NBT/BCIP（Vial5）对尼龙膜进行免疫检测。
比较地高辛标记DNA与对照DNA的一系列稀释点的强度。
所需附加溶液的制备
请找出下表中的成分和所需制备的试剂。
下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA酶和RNA酶系列产品中获得。
请注意：
这些溶液也用于3.6中的检测步骤，可大批量准备
溶液
成分/制备
储存/稳定性
用途
洗涤缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
pH7.5（20℃）
0.3%（v/v）Tween20
15-25℃,稳定
去除未结合的抗体
马来酸缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
用NaOH（固体）调节pH值到7.5（20℃）
15-25℃,稳定
封阻液的稀释
检测缓冲液
0.1MTris-HCl
0.1MNaCl
pH9.5（20℃）
15-25℃,稳定
调整pH值到9.5
TE缓冲液
10mMTris-HCl
1mMEDTA
pH8.0
15-25℃,稳定
终止颜色反应
试剂盒工作溶液的制备
下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：
溶液
成分/制备方法
储存/稳定性
用途
封阻溶液
用马来酸缓冲液按照1：
10的比例将10×封阻液（vial6）稀释成1×工作溶液
现配现用
封阻膜上非特异结合位点
抗体溶液
每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP（4号管）10000rpm离心5分钟。
然后从表面小心吸取所需用量。
用封阻溶液按照1：
5000（150mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP
2-8℃，12h
与地高辛标记的探针结合
底物显色液
取40μLNBT/BCIP（5号管）
于2ml检测缓冲液中混匀
注意：
避光保存
现配现用
抗体结合的可视化
稀释系列
根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（Vial2）应该稀释到1ng/μL。
利用第3.2章中图表1可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。
产量取决于起始时的模板量和孵育时间。
注意：
表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。
按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。
管
DNA
（μL）
来自于管#
DNA稀释缓冲液（3号管）
（μL）
稀释比例
终浓度
1
稀释的原液
1ng/μL
2
5
1
495
1：
100
10pg/μL
3
15
2
35
1：
3.3
3pg/μL
4
5
2
45
1：
10
1pg/μL
5
5
3
45
1：
10
0.3pg/μL
6
5
4
45
1：
10
0.1pg/μL
7
5
5
45
1：
10
0.03pg/μL
8
5
6
45
1：
10
0.01pg/μL
9
0
-
50
-
0
操作步骤
下面的步骤描述的是直接检测。
注意：
在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。
步骤
操作
1
分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1μL点在尼龙膜上
2
通过紫外交联或者120℃烘烤30分钟的方法将核酸固定在膜上
3
将膜转移到一个装有20mL马来酸缓冲液的塑料容器中
在15-25℃中振荡孵育2分钟
4
在10mL封阻液中孵育30分钟
5
在10mL抗体溶液中孵育30分钟
6
用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟
7
在10mL检测缓冲液中平衡2-5分钟
8
将孵育膜放入盛有准备好的2ml底物显色液的盒子中，避光。
在显色过程中不能摇动。
注意：
几分钟后沉淀颜色开始形成，短时间内可适当打开盒子观察染色情况
9
当得到预期的斑点或者聚焦强度已经完成，则停止反应，用无菌双蒸水50ml或者TE缓冲液洗膜5min
结果可以用影印湿过滤器或者摄影记录
结果分析
比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA的量。
如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照DNA的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。
孵育时间
现象
5-10分钟
30pg斑点
30分钟
3pg斑点
3.4DNA的转移和固定
转移方法和膜
凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。
胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题。
所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验（4,5）；
在实验中，在20×SSC中采用毛细管转移的方法将DNA转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。
注意：
碱性转移（如在0.4MNaOH中）不适用于地高辛分子量的标记的转移。
固定操作
将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用
那么
紫外交联的方法
（尼龙膜）
将膜放到已经用10×SSC浸透的Whatman3MM滤纸上。
洗涤之前用紫外交联这块湿润的膜
紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干。
120℃，烘烤（尼龙膜）
在2×SSC中洗涤一下膜
将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。
80℃，烘烤（尼龙膜）
在2×SSC中洗涤一下膜
将尼龙膜放在80℃下真空烘烤2小时
膜的储存
请根据下表选择膜的储存方法。
如果
那么
你想继续实验
立即将这个膜进行预杂交
如果你想稍后进行实验
那么将干燥的膜储存于2-8℃
3.5杂交
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