植物组织培养实验指导.docx
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植物组织培养实验指导
实验一培养基母液的配制
一、目的要求
通过对MS培养基母液的配制，学习掌握培养基母液配制方法。
二、说明
在配制培养基时，为了取用方便和提高各种药品称量的准确性，往往先把各组成成分按其需用量配成扩大一定倍数的浓缩液，即母液贮存备用，用时稀释。
配制母液时，一般按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。
如把所有大量元素配在一起，配成大量元素母液，把微量元素放在一起配成微量元素母液，以及单一的维生素、铁盐、植物激素等母液。
母液扩大的倍数主要取决于用量的多少，用量大的扩大的倍数宜低，反之则高，但要注意过高浓度和不恰当的混合会引起沉淀，影响培养效果。
三、仪器和药品
电子天平1/1000、1/10000。
药品按MS培养基配方准备。
激素按需要准备。
四、方法和步骤
一）、大量元素母液：
因大量元素用量大，为避免过高浓度的混合液会发生沉淀，一般配成10倍的母液。
根据所选培养基配方，按大量元素在表中排列顺序，以其10倍用量用1/1000天平逐个称出，按次序加入盛有蒸馏水的烧杯中，并搅拌。
注意每种溶解后，再加下一种。
原则上应注意把Ca2+与SO4-PO4错开，以免产生沉淀，最后加蒸馏水定容至刻度，此即大量元素母液。
配培养基时，每配一升，取母液100ml。
二）、微量元素母液：
微量元素因用量小，为称量方便及精确，常配成100倍或1000倍的母液，即将每一种微量元素化合物的量扩大100倍或1000倍，分别称量、溶解、定容，方法向上。
配1升培养基取母液10ml或1ml。
本实验配成100倍。
三）、铁盐
铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。
目前常用的铁盐为FeSO4·7H20，由于在使用过程中容宜产生Fe（OH）3沉淀，一般先将其配成螯合物。
常配成100倍称取FeSO4·7H2O，Na2-EDTA，分别加热溶解，然后混合、定容，或混合后加热，至呈黄色，定容。
每配制1升用10ml。
注意：
在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2-EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，FeSO4会结晶析出。
为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeSO4和Na2-EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色（约加热20-30min），调pH值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。
四）、有机物质：
主要指氨基酸及维生素类物质，配成100倍母液。
按100倍量分别称取、定容，方法同上。
配一升培养基取母液10ml。
注意：
由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。
被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。
避免此现象发生的方法是:
配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。
上述四种MS培养基母液的配制见表1-1
五）、植物激素：
各种激素是分别用感量为0.0001g的分析天平称量，分别用容量并配成所需浓度（0.2-1mg/ml）的单一母液。
用时，根据不同的配方要求分别加入。
最常用的植物激素有：
1）、生长素：
如2,4-D，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA），吲哚丁酸（IBA）等。
对于这类物质，配制时先按要求称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用少许0.1NNaOH溶解，或用少量95%酒精溶解，再加水定容至所需浓度。
2）、细胞分裂素：
如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（BAP），激动素（KT），异戊烯腺嘌呤（2-iP）。
配制这类物质类时，应先用少量0.5或1NHCl溶解，然后再加水定容。
3）、赤霉素：
常用GA3。
配制时，先用少量95%酒精溶解，然后再加水定容，过滤灭菌。
以上所说的各种母液均应倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、倍数（或浓度）、日期，并应放入2-4℃冰箱中保存存，以免变质、长霉。
使用时，如出现浑浊或沉淀以及微生物污染，则不宜再用。
至于蔗糖、琼脂等可按配方中要求酌情变动，随称随用。
五、作业：
1、欲配制MS（1962）培养基附加IBA0.2mg/1，BA2mg/11000毫升、500毫升、300毫升，需取用各母液各多少毫升？
请列表说明。
2、在母液的配制、贮存及使用中应注意哪些问题？
表1-1MS培养基母液的配置
成份
培养基配方用量（mg/L）
每升母液用量（mg）
母液扩
大倍数
每升培养基用量（ml）
大量元素（母液1）
KNO3
NH4NO3
MgSO4·7H20
KH2PO4
CaCl2.2H20
1900
1650
370
170
440
19000
16500
3700
1700
4400
10
100
微量元素（母液11）
MnSO4·4H20
ZnSO4·7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4·2H20
CuSO4·5H20
CoCl2·6H20
22.3
8.6
6.2
1.83
0.25
0.025
0.025
2230
860
620
83
25
2.5
2.5
100
10
有机成分（母液III）
甘氨酸
盐酸硫氨素
盐酸吡哆素
烟酸
肌醇
2
0.4
0.5
0.5
100
200
40
50
50
10000
100
10
铁盐（母液IV）
FeSO4·7H20
Na2EDTA·2H20
27.85
37.25
2785
3725
100
10
实验二培养基配制与灭菌
一、目的要求：
以MS培养基为例，熟悉培养基配制与灭菌的操作方法。
二、说明：
培养基是将植物细胞或组织生长所需要的各种营养物质，用人工方法配制成的一种营养基质。
除含有水份、碳水化合物、无机盐外，还有各种必要的维生素、有机附加物及生长调节物质。
并根据植物细胞或组织生长的需要，将培养基的PH值调节在一定范围内。
按照是否在培养基中加入琼脂等凝固剂，培养基又分为固体培养基和液体培养基。
由于不同的植物细胞或组织营养要求不同，人们设计了各种培养基。
常用的基本培养基有MS培养基（MurashigeandSkoog,1962）,B5培养基（Gamborgetal,1968）,N6培养基（Chuetal,1974）等。
培养基含有的各种营养物质，对细菌和霉菌等微生物来说也是很好的营养物质。
微生物在培养基中往往比植物细胞生长更为迅速，并且产生霉素，可致植物细胞死亡。
因此，为防微生物污染，培养基配制好后需及时进行灭菌处理。
三、仪器和药品：
普通天平，烧杯（100ml、300ml、500ml），三角瓶（50ml），量筒（50ml、500ml），移液枪（10ml、2ml、1ml、0.1ml）、搅拌器、PH仪、培养瓶等。
蔗糖、琼脂、1NHC1，0.1NHC1，1NNaOH，培养基母液。
四、方法和步骤：
一）、MS培养基的配制：
MS培养基组成见附表1-1，取用实验一配制的母液，每组配制1000ml分装20瓶。
1、根据MS培养基配方，各种母液的浓度及要求配制的总量，计算好需各种母液的量。
取1000ml烧杯一只，加入700ml水，用量筒和移液枪量取大量元素、微量元素、铁盐、有机物等母液，按需要加入植物激素（浓度临时确定）。
2、加入30g蔗糖，磁力搅拌器溶解后，定容至1000ml。
3、用1MNaOH（或KOH）或0.1MHC1将PH调整5.8。
4、加入8g琼脂粉，微波炉溶化。
5、分装,封口（塑料盖、铅铂纸等）。
二）、培养基的灭菌：
培养基灭菌的方法有多种，但似高压蒸汽灭菌法最为常用。
其方法：
1、打开灭菌锅盖，向外层锅内加水到与锅底的支架平齐。
2、将待灭菌的培养基、蒸馏水、滤纸等其它物品放入灭菌锅的铝筒内，最好装完后，在上面放几层牛皮纸或纱布、毛巾等，防止水蒸汽从锅顶冷凝滴下打湿包头纸。
然后盖好锅盖，按相对方向拧紧螺旋，使锅密闭。
3、打开电源，调整好灭菌时间（因灭菌锅类型不同，操作有差异）。
4、待压力降至零时，切断热源，打开盖子，取出灭菌物品。
高压蒸汽灭菌注意事项：
由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间应适当考虑，对高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具等可延长灭菌时间或提高灭菌压力，而对培养基灭菌既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中成份变质或效力降低，因此必须严格遵守时间。
随容器大小而变化的培养基灭菌时间，可以参考表2-1，但还要考虑锅内总物品的多少。
如果容器大，但数量很少，仍可减少时间。
一定注意，待气压降至0时，才能开盖，否则危险。
表2-1培养基高压蒸汽灭菌所需要的最少时间
Biond和Thorp（1981）
容器的体积
（ml）
在121℃下灭菌所需要的最少时间
（min）
20-50
75-150
250-500
1000
1500
2000
15
20
25
30
35
40
实验三培养材料的消毒与无菌操作
一、目的要求：
培养材料的消毒、无菌操作是组织培养中一个很重要的环节。
通过实际操作，达到初步掌握材料灭菌、接种等技术。
二、仪器、药品和实验材料：
镊子、解剖针、手术刀、剪刀、酒精灯、棉球、广口瓶、火柴、培养皿（无菌）、无菌滤纸，超净工作台。
0.1%氯化汞，70%酒精，无菌水等。
作物、果树、蔬菜、花卉等植物的茎尖，带芽的茎段及叶子等。
三、步骤和方法：
一）培养基准
按培养材料的要求，配制好培养基（本实验用实验二所配培养基）。
二）培养材料的表面消毒
为了保证成功地进行培养，材料在接种前必需进行消毒。
因为生长在自然界中的各种植物身上都沾有各种各样的微生物或真菌孢子，一旦带进培养基，它们就会迅速滋长，从而使实验前功尽弃。
消毒的一个基本原则既要把材料表面上附着的微生物杀死，又不伤害材料内部的组织、细胞，因此，消毒所采用药剂的种类、浓度、处理时间短，均应根据材料的种类，组织老、嫩，毛的有无及材料对药剂的敏感性来定。
从田间选取生长健壮无病虫害嫩茎，用水冲洗干净，放入广口瓶中，先到入70%酒精漂洗一下，然后倒入0.1氯化汞（或10%次氯酸纳）进行表面消毒，消毒时间的长短视材料而定，一般是5-12分钟或更长，药剂浸泡过程中应不断摇动，然后在操作工作台上用无菌水冲洗3-5次，准备接种。
如果选取材料为果树或木本花卉未萌动或刚刚萌动的芽，一般可进行两次灭菌。
先将枝条采回，用刀片将芽（带一定木质部）割下放入广口瓶中用0.1%升汞进行第一次消毒，此次消毒因有鳞片包被，时间可稍长，5-15分钟，用无菌水冲洗三次后，进行鳞片及幼叶剥离，然后再进行第二次消毒，此次消毒时间宜短，1-2分钟，用无菌水冲洗三次后剥取茎尖接种。
材料的消毒超净工作台上进行。
三）、无菌操作：
经消毒后的材料，还必须在无菌条件下接种到培养基中（即无菌操作），进行无菌培养，具体操作如下：
1、在无菌室或超净工作台上摆好酒精灯，盛70%酒精棉球的广口瓶、无菌培养皿、无菌滤纸、镊子、剪刀、手术刀、解剖针、火柴及无菌水、配制好的培养基等。
2、开无菌室（包括缓冲间）紫外灯灭菌20分钟，超净工作台也要提前15-20分钟开机过滤空气，然后，可以用70%酒精喷雾降尘。
3、操作前先用70%酒精球把手（特别是指尖）、工作台面及放入台面上的所有操作用具、器皿等都擦一遍，以清除尘粒。
点燃酒精灯，把操作用的器械（镊子、剪刀、手术刀、解剖针等）再放在酒精灯上烧灼灭菌。
烧灼灭菌后放在支架上待用。
4、培养并按培养基处理整齐放在一边。
注意不要把过滤的无菌风挡着。
5、装有接种材料的瓶子消毒后，在无菌条件下用无菌水冲洗3-4次，然后把水倒干，瓶子最好倒着放，瓶口朝前，这样操作方便，又可避免真菌孢子经瓶口掉到材料上造成污染。
6、轻轻打开包头纸和棉塞，将瓶口迅速在火焰上灼热灭菌（瓶口转动一圈），然后轻轻放在工作台上。
7、用镊子取出待接种材料置于垫有无菌滤纸的无菌培养皿内，重换一把镊子进行材料的解剖、剥离和切割等。
例如，采用芽则需剥去鳞片和幼叶，用刀切取适当大小茎尖，立即接种到培养基上。
如果采用茎段培养。
一般切成带一个芽（芽最好位于中央）的茎段接种培养。
如果接种材料较大，不容易很快失水也可以先完成第七步，再去完成第六步。
8、在酒精灯上方，左手握住三角瓶，一般使瓶倒倾斜，右手用镊子将材料均匀地摆放到培养基表面（茎尖要切口朝下接种到培养基上）。
按原方向插入培养基，使腋芽露在培养基之上。
将瓶口再在酒精灯火焰上转动烧一圈，并在火焰旁盖瓶塞。
扎好皮筋，作好标记，放在一边。
最后一起放入培养室。
为了防止交叉感染，工具要用一次烧灼灭菌一次，滤纸也要及时更换。
操作人员手指也要经常用70%酒精擦一下。
在接种过程中严禁讲话、咳嗽和走动。
9、超净工作台使用完毕，关闭电源。
四）、接种后的污染调查
接种后一周，调查污染情况并将调查结果填入表内：
表3-1接种污染情况调查表
观察日期年月日
接种日期
接种数（瓶）
污染数（%）
主要污染菌种
备注
实验四茎尖培养生产脱毒苗
一、目的要求：
通过实际操作，掌握茎尖剥取接种、培养等技术。
二、仪器、工具、实验材料等
仪器、工具（同实验三）
实验材料：
植物茎尖
三、方法步骤：
1、培养基
MS+0.2mg/LNAA+2.0mg/LBAP
2、材料的消毒
同实验三
3、茎尖剥取与接种
超净工作台内解剖镜下，剥取生长点（带1-2个叶原茎），随即接种到培养上，封口。
4、培养
培养条件：
25±1℃，每日13h光照，3000lux
当长出不定芽后，接种到新的MS基本培养基上，使其长成完整植株。
实验五叶片、叶柄组织培养及快速繁殖
一、目的要求：
学习掌握叶片、叶柄组织培养及快速繁殖的基本方法和操作技术。
二、仪器、工具、材料等
仪器、工具（同实验三）
实验材料：
幼嫩植物的叶片、叶柄
三、实验方法和步骤：
1、培养基：
诱导培养基：
（1）MS+NAA+BAP
（2）MS+2.4-D+KT
再分化培养基
（3）MS
（4）MS+BAP
2、材料接种
将叶片去掉边缘和主脉，切成5mm×5mm，叶柄切成5mm的段，然后接种到培养基上。
3、培养
培养条件：
25±1℃，每日13h光照，3000lux。
诱导丛生芽或不定芽。
（1）
（2）培养基上形成不定芽或愈伤组织后，转到（3）（4）培养基上继续培养，植株再生或不定芽形成，将再生植株转移到新的培养基上，可长成完整植株。
4、驯化移栽
表5-1愈伤组织形成及不定芽分化调查表
观察日期年月日
培养基
外植体
接种外植体数
形成愈伤组织数（%）
形成不定芽的
外植体数（%）
实验六鳞茎培养及快速繁殖
一、目的要求：
鳞茎植株，可通过切割鳞茎，进行培养，实现快速繁殖。
二、仪器、工具等
仪器、工具（同实验三）
三、实验材料：
鳞茎植株的侧芽或由其培养诱导的小鳞茎。
四、实验方法步骤
1、材料灭菌（同实验三）
2、培养基：
MS+NAA+BAP
3、茎尖剥取及培养
解剖镜下，剥取茎尖，接种到培养基上进行培养，使其形成小鳞茎。
4、快速繁殖
将以上形成的鳞茎，纵切成2-4块，进行培养，重复切割、培养，达到快繁的目的。
当不再切割时，可形成植株。
5、培养条件25±1℃，每日13h，光照3000lux。
6、驯化移栽。
实验七培养材料的继代选择
一、目的要求：
1、掌握无菌材料的选择原理、增殖培养技术
2、了解材料生长的基本规律
3、了解植物激素的作用
二、仪器、药品和实验材料
镊子、手术刀、剪刀、酒精灯、棉球、培养皿、超净工作台培养基、70%酒精。
三、步骤、方法
1、根据植物材料的生长情况，确定培养基的种类及激素的配比，配制培养基（方法见实验二）。
2、选择培养材料：
选择生长旺盛的无菌材料，一般选择材料的顶端或新增殖的芽。
3、继代培养：
将选择的材料整理、剪接，接种到培养基中（方法见实验三）。
实验八材料的驯化移栽
一、目的要求：
经培养再生植株，不能直接移栽土壤，否则不易成活，必须经过逐步驯化后，才能移栽。
通过实验，学习掌握试管苗的驯化移栽方法。
二、步骤和方法
1、移栽基质的准备
基石、草炭土灭菌后，按1：
1的比例混合，装入营养钵。
2、试管苗的驯化
将大小适宜的试管苗，其培养瓶稍开口，第二天打开盖，炼苗4-7天。
3、移栽
试管苗取出后，洗净根部培养基（否则易长苗），移栽于准备好的营养钵中，浇水，并保持较高的空气湿度。
待成活后，移栽于温室，塑料大棚等。
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