细菌内毒素检查方法国际药典0424.docx

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细菌内毒素检查方法国际药典0424

MethodsofAnalysis:

3.Biologicalmethods:

3.4Testforbacterialendotoxins

分析方法：

3.生物方法：

3.4细菌内毒素的检查

Thistextisbasedontheinternationally-harmonizedtextsdevelopedbythe

PharmacopoeialDiscussionGroup（PDG）.SomeeditorialmodificationshavebeenmadeinordertobeinlinewiththestyleusedinTheInternationalPharmacopoeia.

本文是根据药典讨论组（PDG）的国际协调文件编写的。

为了使其与国际药典的格式一致，对其作了一些编辑修订。

Thebacterialendotoxinstest（BET）isatesttodetectorquantifyendotoxinsfromGram-negativebacteriausingamoebocytelysatefromthehorseshoecrab（LimuluspolyphemusorTachypleustridentatus）.Therearethreemethodsforthistest:

细菌内毒素检测（BET）是指用鲎（Limuluspolyphemus或Tachypleustridentatus）的变形细胞溶解物（鲎试剂）来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的内毒素。

有以下三种方法：

●MethodA.Thegel-clottechnique,whichisbasedongelformation;

方法A：

凝胶凝结技术，此方法基于凝胶的形成。

●MethodB.Theturbidimetrictechnique,basedonthedevelopmentofturbidityaftercleavageofanendogenoussubstrate;

方法B：

浊度技术，此方法基于内源性底物分裂后所产生的浊度。

●MethodC.Thechromogenictechnique,basedonthedevelopmentofcolouraftercleavageofasyntheticpeptide-chromogencomplex.

方法C：

显色技术，此方法基于合成的肽显色复合物裂解后产生的颜色。

UnlessotherwiseindicatedintheindividualmonographproceedbyMethodA.

除在单独的检测专著中另有规定外，采用方法A。

Thetestiscarriedoutinamannerthatavoidsendotoxincontamination.

试验过程中应防止内毒素污染。

APPARATUS器械

Depyrogenateallglasswareandotherheatstablematerialsinahotairovenusingavalidatedprocess.Acommonlyusedminimumtimeandtemperatureis30minutesat250°C.Ifemployingplasticapparatussuchasmicroplatesandpipettipsforautomaticpipetters,useapparatusshowntobefreeofdetectableendotoxinandwhichdoesnotinterfereinthetest.

用已验证过的方法在热风烘箱内对所有的玻璃器具和其他耐热材料进行去热原处理，通常此操作设定的最短时间和最低温度问30分钟和250°C。

若使用到塑料器具，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并试验无干扰的器械。

Note:

Inthischaptertheterm"tube"includesanyotherreceptaclesuchasamicro-titrewell.

注意：

此章节中的“管状容器”包括其他任何例如微孔板中的孔一类的容器，。

REAGENTSANDTESTSOLUTIONS试剂和检测用溶液

●Amoebocytelysate鲎试剂

Alyophilizedproductobtainedfromthelysateofamoebocytes（whitebloodcells）fromthehorseshoecrab（LimuluspolyphemusorTachypleustridentatus）.

由鲎（Limuluspolyphemus或Tachypleustridentatus）的变形细胞（血液白细胞）的溶解产物得到的冻干产品。

Note:

Amoebocytelysatereactstosomeβ-glucansinadditiontoendotoxins.Amoebocytelysatepreparationswhichdonotreacttoglucansareavailable:

theyarepreparedbyremovingtheGfactorreactingtoglucansfromamoebocytelysateorbyinhibitingtheGfactorreactingsystemofamoebocytelysateandmaybeusedfortheendotoxintestinginthepresenceofglucans.

注：

鲎试剂除内毒素外还与一些β-葡聚糖反应，但也有不与葡聚糖反应的鲎试剂。

通过在制备时除去鲎试剂中能与葡聚糖反应的G因子或通过抑制鲎试剂中G因子的反应系统来得到此种鲎试剂，这种鲎试剂可用来检测含有葡聚糖的产品中的细菌内毒素。

●Lysatesolution鲎试剂溶液

DissolveamoebocytelysateinwaterBETorinabufferrecommendedbythelysatemanufacturer,bygentlestirring.Storethereconstitutedlysate,refrigeratedorfrozen,accordingtothespecificationsofthemanufacturer.

用BET水或鲎试剂生产商推荐的缓冲液来溶解鲎试剂，缓缓搅拌。

根据生产厂家的说明书对新形成的鲎试剂进行冷藏或冷冻保存。

●WaterBET（waterforbacterialendotoxinstest）BET水（细菌内毒素检测用水）

Waterforinjectionsorwaterproducedbyotherproceduresthatshowsnoreactionwiththelysateemployed,atthedetectionlimitofthereagent.

注射用水或用其他程序生产的检测限度内不与鲎试剂发生反应的水。

PreparationofStandardEndotoxinStockSolution标准内毒素贮备液的配制

AStandardEndotoxinStockSolutionispreparedfromtheWHOInternationalStandardforendotoxin（availablefromtheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl（NIBSC）,UnitedKingdomofGreatBritain）oranendotoxinreferencestandardthathasbeencalibratedagainsttheWHOInternationalStandardforendotoxin.FollowthespecificationsinthepackageleafletandonthelabelforpreparationandstorageoftheStandardEndotoxinStockSolution.

标准内毒素贮备液是用WHO内毒素国际标准（英国国家生物标准和控制学会（NIBSC）制定的标准）或由根据WHO内毒素国际标准校准后的内毒素标准品而制备得到的。

根据说明书和标签上的要求制备及储存标准内毒素贮备液。

EndotoxinisexpressedinInternationalUnits（IU）ofendotoxin.

内毒素用国际单位（IU）来表示。

Note:

OneInternationalUnit（IU）ofendotoxinisequaltooneEndotoxinUnit（EU）.

注：

1个国际单位（IU）等于1个内毒素单位（EU）。

PreparationofStandardEndotoxinSolution标准内毒素溶液的制备

AftermixingtheStandardEndotoxinStockSolutionvigorously,prepareappropriateserialdilutionsofStandardEndotoxinSolution,usingwaterBET.

在剧烈的混匀标准内毒素贮备液后，用BET水对其进行稀释以制备适当的系列稀释液，即标准内毒素溶液。

Usedilutionsassoonaspossibletoavoidlossofactivitybyadsorption.

稀释液应尽快使用，以避免因吸附而导致活性损失。

Preparationofsamplesolutions供试品溶液的制备

PreparesamplesolutionsbydissolvingordilutingthepharmaceuticalsubstanceorthefinishedpreparationusingwaterBET.Somesubstancesorpreparationsmaybemoreappropriatelydissolvedordilutedinotheraqueoussolutions.Ifnecessary,adjustthepHofthesolutiontobeexamined（ordilutionthereof）sothatthepHofthemixtureoftheLysatesolutionandsamplesolutionfallswithinthepHrangespecifiedbythelysatemanufacturer,usually6.0–8.0.ThepHmaybeadjustedbytheuseofacid,baseorsuitablebufferasrecommendedbythelysatemanufacturer.AcidsandbasesmaybepreparedfromconcentratesorsolidswithwaterBETincontainersfreeofdetectableendotoxin.Buffersmustbevalidatedtobefreeofdetectableendotoxinandinterferingfactors.

通过BET水溶解或稀释药用物质或成品制剂来制备供试品溶液。

一些药用物质或成品制剂更适于用其他的水溶液来进行溶解或稀释。

如果需要的话，调节供试品溶液（或其稀释液）的PH值以使鲎试剂溶液与供试品溶液的混合液的PH值符合鲎试剂生产商规定的PH值范围，此范围通常为6.8-8.0。

可使用鲎试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲液来调节PH值。

所使用的酸和碱溶液可以用其浓缩物或固体物在没有内毒素的容器中，用BET水进行配制。

所使用的缓冲液必须进行验证以证明其没有内毒素和干扰因子。

DETERMINATIONOFMAXIMUMVALIDDILUTION确定最大有效稀释倍数

Themaximumvaliddilution（MVD）isthemaximumallowabledilutionofasampleatwhichtheendotoxinlimitcanbedetermined.

最大有效稀释倍数（MVD）指在能够确定内毒素限度时供试品允许被稀释的最大倍数。

DeterminetheMVDfromthefollowingequation根据下面的公式计算MVD:

MVD=

Endotoxinlimit内毒素限度

Theendotoxinlimitforparenteralpreparations,definedonthebasisofdose,equalsK/M,whereKisathresholdpyrogenicdoseofendotoxinperkgofbodyweightandMisequaltothemaximumrecommendedbolusdoseofproductperkgofbodyweight.Whentheproductistobeinjectedatfrequentintervalsorinfusedcontinuously,Misthemaximumtotaldoseadministeredinasinglehourperiod.

非胃肠道给药制剂内毒素限度根据其剂量来确定，等于K/M。

K指每千克体重可接受的内毒素的致热剂量阈值，M指每千克体重建议的最大注射剂量。

如果一种药品以较短的时间间隔频繁注入或连续输入体内，那么M就是指在一小时内使用的最大总剂量。

Note:

Theendotoxinlimitdependsontheproductanditsrouteofadministrationandisstatedintheindividualmonograph.SuggestedvaluesforKare:

注：

内毒素标准取决于产品和其使用途径，并且在单独的专论中有规定。

建议的K值如下：

-intravenousroute:

K=5IUendotoxinperkgbodyweight;

静脉注射给药：

K=5IU内毒素/千克体重

-intravenousrouteforradiopharmaceuticals:

K=2.5IUendotoxinperkgbodyweight;

放射性药物静脉注射给药：

K=2.5IU内毒素/千克体重

-intrathecalroute:

K=0.2IUendotoxinperkgbodyweight.

鞘内注射给药：

K=0.2IU内毒素/千克体重

Forotherroutesofadministrationtheacceptancecriterionforbacterialendotoxinsisgenerallydeterminedonthebasisofresultsobtainedduringdevelopmentofthepreparation.

采用其他给药途径时，细菌内毒素的可接受标准一般是根据研发过程中得到的结果来确定的。

TheendotoxinlimitforparenteralpreparationsisspecifiedinunitssuchasIU/ml,IU/mg,IU/Unitofbiologicalactivity,etc.,intheindividualmonograph.

非胃肠道给药制剂的内毒素限度以IU/ml、IU/mg,、IU/生物活性单位等等来表示，在单独的专论中有规定。

Concentrationofsamplesolution:

供试品溶液的浓度

-mg/mlinthecaseofendotoxinlimitspecifiedbyweight（IU/mg）;

如果内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示供试品浓度；

-units/mlinthecaseofendotoxinlimitspecifiedbyunitofbiologicalactivity（IU/Unit）;

如果内毒素限度以生物活性单位（IU/Unit（单位））表示时，用units（单位）/ml表示供试品浓度；

-ml/mlwhentheendotoxinlimitisspecifiedbyvolume（IU/ml）.

如果内毒素限度以体积（IU/ml）表示时，用ml/ml表示供试品浓度；

λ:

thelabelledlysatesensitivityinthegel-clottechnique（IU/ml）orthelowestconcentrationusedinthestandardcurvefortheturbidimetricorchromogenictechniques.

λ：

指用凝胶法检测时鲎试剂标示灵敏度（IU/ml）或指用浊度或显色法检测时运用于标准曲线上的最低浓度。

METHODA:

GEL-CLOTTECHNIQUE方法A：

凝胶法

Thegel-clottechniqueisfordetectingorquantifyingendotoxinsbasedonclottingoftheLysatesolutioninthepresenceofendotoxin.TheminimumconcentrationofendotoxinrequiredtocausethelysatetoclotunderstandardconditionsisthelabelledsensitivityoftheLysatesolution.Toensureboththeprecisionandvalidityofthetest,performthetestsforconfirmingthelabelledlysatesensitivityandforinterferingfactorsasdescribedbelowunderPreparatorytesting.

凝胶法指基于溶液中的内毒素与鲎试剂产生凝聚反应而检测或定量内毒素的方法。

在标准条件下要求的使鲎试剂凝结的内毒素浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。

为了保证检测的精确性和有效性，按照准备试验下规定的方法来复核鲎试剂的标示灵敏度和干扰因子。

Preparatorytesting准备试验

Testforconfirmationoflabelledlysatesensitivity

鲎试剂标示灵敏度确认试验

Confirminfourreplicatesthelabelledsensitivity,λ,expressedinIU/mlofthelysatepriortouseinthetest.Thetestforconfirmationofthelysatesensitivityistobecarriedoutwhenanewlotoflysateisusedorwhenthereisanychangeinthetestconditionswhichmayaffecttheoutcomeofthetest.

用4个平行样来确认鲎试剂的标示灵敏度λ，在开始试验前将其转换为用IU/ml的形式来表示。

当使用新批号的鲎试剂或当试验条件发生了任何可能影响试验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度确认试验。

Preparestandardsolutionshavingatleastfourconcentrationsequivalentto2λ,λ,0.5λand0.25λbydilutingtheStandardEndotoxinStockSolutionwithwaterBET.

用BET水将标准内毒素贮备液稀释，至少制备相当于2λ,λ,0.5λ和0.25λ四个浓度的标准溶液。

MixavolumeoftheLysatesolutionwithanequalvolumeofoneofthestandardsolutions（suchas0.1mlaliquots）ineachtube.Whensingletestvialsorampoules,containinglyophilizedlysateareemployed,addsolutionsofstandardsdirectlytothevialorampoule.Incubatethereactionmixtureforaconstantperiodaccordingtodirectionsofthelysatemanufacturer（usuallyat37±1°Cfor60±2minutes）,avoidingvibration.Testtheintegrityofthegelfortestscarriedoutintubes,takeeachtubeinturndirectlyfromtheincubatorandinvertitthroughapproximately180degreesinonesmoothmotion.Ifafirmgelhasformedthatremainsinplaceuponinversio