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黑花生衣色素稳定性研究

黑花生衣色素稳定性研究

学   生：

曾宪峰

指导老师：

李清明

（湖南农业大学科学技术师范学院，长沙410128）

摘 要：

黑花生衣色素是黑花生种皮浸出的一种天然食用花青素类色素,本文对黑花生衣色素在不同条件pH值、不同离子、不同温度下进行了稳定性分析，旨在为开发和利用这一色素提供一定的理论依据。

分析结果表明：

该色素在酸性条件下稳定；Al3+、Fe3+对该色素影响大，Cu2+、K+、Mn2+、Mg2+、Zn2+对色素影响小；在pH3.4时该色素热稳定性好，活化能为31.84KJ/mol，在pH4.5下该色素热稳定性较差，活化能为21.13KJ/mol。

关键词：

黑花生衣色素；花色素苷；稳定性； 

Studyonthestabilityofblackpeanutskinpigment

Student:

ZengXianfeng

Tutor:

LiQingming

（NormalCollegeofScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China）

Abstract：

Theblackpeanutskinpigmentisakindofnaturalcyaninewhichwasextractedfromblackpeanutskin.TheeffectsofpHvalue,7kindsofmetalionsandtemperatureonthepigmentstabilitywerestudiedrespectively.Theresultsshowedthatthepigmentwasstableunderacidconditions.SuchmetallicionsasCu2+,K+,Mn2+,Mg2+andZn2+hadlittleeffectoncolorofpigment,whileFe3+andA13+hadnegativeeffect.AtpH3.4,thethermaldegradationactivationenergy（E0）ofthepigmentwas31.84kJ/mol,AtpH4.5,thethermaldegradationactivationenergy（E0）ofthepigmentwas21.13kJ/mol.

Keywords：

Blackpeanutskinpigment;Anthocyanin;Stability

1 前言 

黑花生是中国农科院油料所和河北省迁安市农业部共同研究的花生新品种[1]。

黑花生的主要特性是：

植株呈半直立型，株高40至50cm，侧枝长50cm。

中早熟，生育期120天左右。

叶色浓绿，连续开花，开花量多，结果率中等，双仁果70％左右。

抗旱抗病性较强，适合中等以上肥力地块种植。

黑花生南方可春、夏播种，北方可在

小麦收割后播种，种植及管理与普通花生相同，每亩用种15kg，一般亩产300kg左右，高产的可达350kg以上。

2002年8月4日经抚州市有关专家进行产量测定，每亩湿花生产量为632kg，按60％折干实际产量为379kg[2]。

黑花生营养价值很高，蛋白质含量高达30.86％，比普通花生高5%，精氨酸含量达3630mg／100g，比普通花生高23.9％，钾、锌、硒含量分别比普通花生高19％、48％、101％，医学专家推荐，一年365天，每天生食9粒（分三次吃）可维持人体血压正常，减少因缺少维生素而造成的多种病症，黑花生对提高生命质量，强身健体是任何食物所不及的[2]。

因此黑花生具有较高的推广种植前景和广阔的加工市场，它将成为种植业结构调整中的亮点，食品消费的视点[1]。

黑花生产量大，果肉营养价值高，颖果可用于生产优质花生油、油炸花生、花生乳、花生酱、提取花生蛋白等，据以往对普通花生的加工，花生衣作为副产物被费弃或者对利用率不高。

近来有大量研究报告表明黑花生皮层含有丰富的天然色素——花色苷，大量研究报告指出，几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，有些合成色素甚至危害人体健康，一些发达国家，天然色素在食品中的比例越来越大，开发和利用天然色素已经成为国内外的趋势。

黑花生是一个含天然花色苷很高的花生新品种[1]，花色苷不仅可用于一些食品的着色,如果酱、果汁、果冻、冰淇淋、糖果等,而且具有突出的生理功能，例如消除自由基活性及抗癌活性、改善视觉功能、改善微循环、降低血清及肝脏中脂肪含量、防止人体内过氧化等作用，其抗氧化作用是维生素E的50倍，是维生素C的20倍[3]。

因此开发和利用这一类色素有着广阔的前景。

目前国内对已有众多学者对杨梅[4]、紫薯[5]、葡萄[6]、桑椹[7]等含天然花色苷色素的稳定性进行了研究，但是对黑花生色素的研究很少，本研究旨在为黑花生的开发和利用提供一定的理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料 

黑花生:

产自河北省迁安市。

2.1.2 仪器

可见分光光度计：

722型，上海棱光技术有限公司；

电热恒温水浴锅：

上海浦东物理光学仪器厂；

离心机：

TGL-16C，湖南星科科学仪器有限公司；

旋转蒸发仪：

RE52-3，上海沪西分析仪器有限公司；

循环式真空泵：

SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司。

2.1.3 试剂 

AR：

乙醇，盐酸，柠檬酸，磷酸氢二钠，氯化钾，氯化铜，三氯化铁，氯化锰，氯化锌，三氯化铝，氯化镁等。

2.2 试验方法

2.2.1 提取工艺

本研究综合沈国惠等[8,9,10,11]对色素的提取工艺进行分析并改进得到如下提取方法：

将黑花生低温烘干后剥取花生衣，用样品粉碎机将花生衣粉碎，20%乙醇分多次提取，第一次提取，固液比为1:

20，时间1h，粗滤，然后采用真空抽滤，滤渣用20%乙醇再次提取，固液比为1:

15，时间1h，过滤，合并滤液，在38℃下真空浓缩。

浓缩至原来体积的1/200左右，避光并低温保存。

2.2.2 溶液中花色苷含量测定

移液枪准确移取1mL色素溶液于两支15mL试管中，分别加入9mL，pH1.0的KCl-HCl缓冲液和9mL，pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（稀释10倍），避光静置1h。

然后分别在波入520nm和700nm处测紫外吸光度值A，得到两支试管中两个不同波长下的四个吸光度，然后按公式

（1）求含量[14，15]。

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5

含量mg/L=（A×MW×DF×1000）/（ε×1）………………………………………

（1）

MW:

黑花生皮色素分子量445.2g/mol

DF：

稀释倍数

ε=摩尔消光系数29600

1：

光程（1cm）

2.2.3 花色苷稳定性研究

（1）花生皮色素在不同pH下的稳定性 按要求配制0.1mol/L的柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，然后按表1配制缓冲溶液，每种缓冲溶液取20mL于25mL具塞试管中，向每支试管加入等量的花色苷浓缩液（在加入花色苷浓缩液前需做预备试验来确定浓缩液使用量，保证最大吸收波长处吸光度在0.7-0.8左右），摇匀，在室温下静置，间隔一定时间取样，然后在520nm下测定其吸光值[5，12，13]，记录数据。

（2）黑花生衣色素在不同金属离子溶液中的稳定性 参考对色素对金属离子存在下的稳定性研究方法的文献[5，12，13]，并进行改进得如下分析方法：

将KCl、CuCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、AlCl3、FeCl3配制成10×10-6mol/L的金属离子母液，然后稀释成三个不同的浓度，置于50mL容量瓶中，然后加入一定量的花色苷浓缩溶液，摇匀，室温下静置，间隔一定时间取样，在520nm下测定吸光度，观察现象并记录结果。

（3）黑花生衣色素热稳定分析 采用四个不同水浴加热温度（55℃、75℃、85℃、100℃）和三个不同的pH值（pH3.4和pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓缓冲液，pH1.0的KCl-HCl缓冲液）做交叉试验。

将浓缩花色苷溶液分别加入到缓冲溶液中，然后分别在不同的水浴温度中加热。

间隔一定时间取10mL样于试管中，置于冰箱中冷却1h，测定溶液中花色苷含量，通过公式

（2）计算得到不同时间的花色苷保存率。

利用保存率Xi对时间t作图得出色素热稳定性曲线。

 Xi=Ai/A0……………………………………………………………

（2）

Xi：

色素保存率

Ai:

t=i时刻溶液中色素含量

A0：

t=0时溶液中色素含量 

花色苷热降解反应为动力学一级反应，根据Arrhenius方程和朗伯——比尔定律分析计算出花色苷在不同条件下的降解速度常数、半衰期、活化能和频率常数。

条件选择依据：

低温下色素的吸光度变化较少，不便衡量其降解反应，故采用较高温度；在测定含量时需要分别在pH1.0与pH4.5的缓冲液中静置1h，因此为了方便操作而选用这两种缓冲液进行降解试验，此外pH3.4下花色苷比较稳定，一般酸性食品最低pH值也只在这个水平上，因此选择这三种缓冲液[6，7，16，17，18]。

3 结果与分析

3.1 不同pH值对花色苷稳定性的影响

通过对最大波长处吸光度测定结果如表2所示，通过试验现象的观察结果如表3所示。

由表2可看出pH1、pH2、pH2.2、pH3这四个pH值下的色素吸光度经过878小时后仍然维持很高的水平，其吸光度没有很大的波动，色素降解很少，呈现稳定的红色。

而pH4、pH5、pH6、pH7、pH8在经过15h后其吸光度都有一定程度的下降，说明色素在15h内结构发生了转化，而后吸光度出现了一段很平的直线，说明在该pH值下色素结构已趋于稳定[4，5，12，19]。

由表3可得，随着溶液pH值的增大，在525nm下吸光减少，色素色调由红色变成蓝绿色，这一特殊现象是花青素的一大特征。

造成这种变化的原因是花青素类色素的结构在溶液中存在四种互变体：

红色的黄钅羊盐结构、蓝色的醌式结构、无色的查耳酮结构、无色的假碱结构。

它们之间存在下列三种平衡关系转换[20，21]：

这些特征表明花色苷结构易受pH值影响，随着pH值的变化而发生色泽和颜色强度变化。

本试验采用的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲溶液有效的阻止了黄钅羊盐结构转化成无色的假碱结构，使其在酸性中显示红色，在碱性中呈蓝色。

3.2        花色苷在不同金属离子下的稳定性

通过对加入金属离子的色素溶液取样测定520nm下吸光度，用吸光度A值对时间t做图得：

锌离子对黑花生衣色素的稳定性影响结果如图2，铜离子对黑花生衣色素的稳定性影响结果如图3，镁离子对黑花生衣色素的稳定性影响结果如图4，钾离子对黑花生衣色素的稳定性影响结果如图5，锰离子对黑花生衣色素的稳定性影响结果如图6。

通过对实验现象的观察，现象结果如表4所示。

由表4对试验现象观察可得Al3+、Fe3+的加入对色素的稳定性影响很大，Al3+加入到色素溶液中立刻出现蓝色沉淀，而将Fe3+加入到色素溶液中立刻出现黑色沉淀，而在其它离子存在的条件下，色素都呈现不同程度的红色。

这与文献[4，5，19，20]中所提到的结论一致。

可能是由于Al3+、Fe3+可与花色苷类物成稳定的络合物所致，因此在利用花色苷作为着色剂时应当避免与Al3+、Fe3+接触。

K+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+这5种离子加入后色素呈红色，对色素影响小，这与文献[4，5，19]中研究所得结果一致。

图2、图3、图4、图5、图6所显示的结果表明：

K+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+这5种离子的三条曲线平行排列，没有太多交叉，说明离子浓度对色素降解趋势没有太大影响，只对色素色泽强度有影响。

本次试验每种离子都使用了三个不同的浓度，分别是1×10-6mol/L、2×10-6mol/L、5×10-6mol/L。

用于测定色素对该种离子的敏感程度。

从图2至图6可以看出，镁离子浓度变化对色素稳定性影响不大；铜离子浓度变化对色素稳定性有较大的影响，浓度在2×10-6mol/L时色素稳定性好；锰离子、锌离子、钾离子浓度在1×10-6mol/L时色素色泽较浅，离子浓度高则溶液色泽深。

综上所述，Al3+、Fe3+对色素稳定性影响大；K+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+对色素稳定性影响小；离子浓度变化只对色素色泽强度有影响。

3.3        黑花生衣色素热稳定性研究

3.3.1 黑花生衣色素在不同温度不同酸度下的稳定性

本试验采用水浴加热法，并为了更准确的表现结果而采用文献[14]中介绍的方法直接测定溶液中色素含量，进而由公式

（2）计算色素保存率。

用色素保存率对时间作图得：

55℃下黑花生衣色素热稳定性如图8，70℃下黑花生衣色素热稳定性如图9，85℃下黑花生衣色素热稳定性如图10，100℃下黑花生衣色素热稳定性如图11。

由图7、图8、图9、图10可得到以下结论：

上面四个曲线图有一个共同的规律，同一温度下的三条曲线基本没有交叉，都是按最上面pH1，中间pH3.4，最下面pH4.5排列，溶液酸度越大在溶液中色素降解越慢，对色素保存越有利，这与文献[6，7，17，18]的研究结果相同。

例如pH1.0在70℃下加热5小时色素只降解了10%，而pH4.5在70℃下加热5小时则降解了25%。

相同pH值下，在高温下色素降解比低温下快的多，色素对热敏感程度较高。

比如pH4.5在100℃下只要6小时就降解了90%以上，而pH4.5在55℃下加热6小时只降解了10%左右。

符合一般物质的降解反应，因此在生产利用这类色素时间应当避免高温处理。

3.3.2 黑花生衣色素热降解动力学模型

一般花色苷的热降解反应符合动力学一级反应规律[18]，根据Arrhenius方程:

       C/C0=e-k×t……………………………………………………………………（3）

        ㏑C/C0=-k×t………………………………………………………………（4）

       t1/2=0.962/k…………………………………………………………………（5）

        k=k0eEo/RT………………………………………………………………………（6）

        ㏑k=-E0/RT+㏑K0……………………………………………………………（7）

其中:

k:

热降解反应常数；  e:

自然数；  C:

花色苷终浓度； T:

温度（K）；

k0:

频率常数；       E0:

热降解反应活化能（kJ/mol）； t:

加热时间（h）；

R:

气体常数（8.314×10-3kJ/mol）；  C0:

花色苷初始浓度

根据朗伯——比尔定律，色素溶液的吸光值A与其浓度成正比，故（4）式也可表示为㏑（A/A0）=-k×t，用㏑（A/A0）对时间t作直线图可求得直线斜率，则斜率即为降解反应速率常数k[18]。

由（5）式可得到色素在该条件下的半衰期t1/2。

按不同温度用㏑（A/A0）对时间t作图得：

55℃下㏑C/C0与时间t的关系如图12所示，70℃下㏑C/C0与时间t的关系如图13所示，85℃下㏑C/C0与时间t的关系如图14所示，100℃下㏑C/C0与时间t的关系如图15所示。

从图11、12、13、14看各图线性关系良好，线性相关系数r在0.99以上。

因此直线斜率即为该条件下的k值，以㏑k对1/T作线性回归，由方程（7）可得直线斜率为-E0/R，截距为㏑K0，由直线的斜率可求出活化能E0，具体求解过程如下[21]。

回归方程求解公式：

通过分析计算所得结果如表7所示。

E0是黑花生衣色素热降解反应所需吸收的能量值，由表7的结果可知：

低pH值时花色苷热降解所需E0值大于高pH值下所需E0，充分说明低pH值时，花色苷以黄钅羊盐结构存在，热稳定性要好，有利于黑花生衣色素的保存。

高pH值下以醌式结构存在，花色苷热稳定性差。

低温下黑花生衣色素半衰期比高温条件下大的多，色素降解慢，利于色素保存。

相同温度下，在低温处pH值对反应常数有很大影响，酸度越大反应常数越小，酸度越高反应常数越大，反应常数越大色素降解越快，越不利于色素保存；在高温处，pH值对反应速率常数影响不大，降解都很快，温度越高各pH值下的速率常数越接近[12]。

4 结论

黑花生衣色素在酸性条件下稳定性好，以黄钅羊盐结构存在，呈现稳定的红色；在碱性条件下稳定性差，以醌型碱结构存在，呈蓝绿色或无色。

该色素适宜用于酸性食品中，在碱性食品中不宜使用。

黑花生衣色素在K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+离子影响较少，离子浓度只影响色素色泽。

Al3+、Fe3+对色素有破坏作用，三价铝离子加入色素溶液中产生蓝色的沉淀，而三价铁离子加入到色素溶液中产生黑色的沉淀。

黑花生衣色素在低pH值下热降解所需活化能大于高pH值下所需活化能，高pH下色素更容易降解。

在pH为3.4时该色素热降解活化能E0为31.84KJ/mol，频率常数为1.82，在pH值为4.5时该色素热降解活化能E0为21.13KJ/mol，频率常数为0.88。

黑花生衣色素在高温下的降解反应速率常数大于低温下的反应速率常数，半衰期比低温下少的多，色素热稳定性差，加热杀菌对色素稳定性不利。

5 讨论

在测定花色苷热稳定性时，采用pH1.0缓冲液，在55℃、70℃、85℃、100℃下加热时，在开始阶段，色素含量测定值有一上升阶段，可能是由于溶液酸度高，溶液中含酸的量相对较高，色素达到完全酰其化所需时间较长所致。

因此本论文在做色素热降解动力学参数求解时没有采用这组数据。

色素中加入金属离子后，经过在室温下长时间放置，色素在525nm下吸光度下降后会有一上升过程，目前很少有文献在这方面作研究。

我认为，可能是在测定过程中由离子间的相互污染所致。

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