植物冰冻切片技术的运用领域及研究进展论文.docx

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植物冰冻切片技术的运用领域及研究进展论文

植物冰冻切片技术的运用领域及研究进展

　　摘要：

　冰冻切片是在低温下将组织材料冻结到一定硬度后进行切片的一种实验技术,具有简便、高效、易操作的优点,是植物研究中主要制片方法之一。

本文对冰冻切片技术在植物组织细胞观察、组织化学研究和分子生物学研究中的应用进行了综述,阐明了其在这些研究中的独特优势,并对样品前处理方法、包埋剂的选择、冷冻时间、冷冻温度和切片厚度等条件进行了讨论,旨在更好地指导冰冻切片技术在植物组织切片中的应用。

　　关键词:

冰冻切片;植物组织;等植物;

　　Abstract：

　Cryo-sectioningisanexperimentalmethodforsectioningtissuematerialafterithasbeenfrozentoacertainstiffnessatlowtemperature,whichhastheadvantagesofsimplicity,efficiency,andeaseofoperation,andisoneofthemainsectioningmethodsinplantresearch.Inthisreview,wesummarizetheapplicationsofcryo-sectioninginplanttissuecellobservation,histochemistryresearchandmolecularbiologyresearch,clarifyitsuniqueadvantagesinthesestudies,anddiscusstheconditionsofsamplepreparation,choiceofembeddingagents,freezingtime,freezingtemperature,andsectionthickness,aimingtobetterguidetheapplicationsofcryo-sectioninginplanttissuesectioning.

　　Keyword：

　cryo-sectioning;planttissue;higherplants;

　　临时切片和永久切片对于植物的科研和教学具有重要的作用。

一直以来,植物切片多采用徒手切片法和石蜡切片法,但徒手切片法切取的植物组织切片常常厚度不均,难以连续切片,且对于太小、太软、太硬的材料也难于切片。

石蜡切片法适用性较广,可以切出薄厚均匀的组织切片,做到连续切片;但石蜡切片操作程序繁琐,制作周期长,而且要使用如二甲苯、乙醇等多种有机试剂,在一定程度上影响了植物化学成分和生物分子的提取与鉴定（张建逵等2013）。

冰冻切片（cryo-sectioning,frozensection）是将生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术;与常规的石蜡切片相比,不经脱水、透明、浸蜡等步骤,因此组织不会收缩,易保持原有生活形态,具有快速、简便、易操作等优点。

目前,冰冻切片技术在动物和人体研究中已有着成熟的冰冻切片条件,成为病理学以及临床医学等方面用来研究和观察组织的形态结构变化的主要手段;但由于植物细胞有中央大液泡,含水量较大,所以较动物样品更容易在冰冻过程中形成冰晶,挤压周围的细胞器,进而损伤植物细胞的细微结构,即“冰晶损伤”,对植物组织细胞的观察产生影响。

同时,由于植物细胞具有细胞壁,使得植物组织在冰冻后硬度变大且易破碎,致使很多情况下难以切出结构完整的切片,也影响了冰冻切片技术在植物组织切片中的应用（宁代锋等2008）。

　　在20世纪80年代至90年代,我国的科研工作者开始尝试将冰冻切片技术应用于植物研究,成功利用冰冻切片技术制作自显影切片,对放射性示踪物在植物组织细胞中的定位进行了研究。

随着近十几年来研究的进展与科技的进步,植物冰冻切片技术已经不仅仅应用于植物器官和组织的显微结构观察,更多的是与激光显微切割、HPLC-MS/MS、质谱成像等技术相结合,进行次生代谢产物的定位、分析和RNA的提取等工作。

但对于不同种的植物,或者植物的不同器官和组织,其质地及含水量差异较大,同动物组织一样固定的几种冰冻切片条件显然无法满足植物冰冻切片的需求。

所以如何筛选植物冰冻切片条件,将不同质地的植物材料制作成组织切片,使其满足于后续的实验需要,是植物冰冻切片研究中所面临的一个重要问题。

本文对植物冰冻切片技术的应用领域及研究进展进行综述,并结合已有的报道对植物冰冻切片的条件进行讨论与概括,旨在更好地指导冰冻切片技术在植物组织切片中的应用。

　　1、植物冰冻切片技术的应用领域及研究进展

　　1.1、植物冰冻切片技术在组织细胞观察中的应用

　　尽管使用石蜡切片法得到的植物组织切片更加清晰完整,但由于其繁琐的操作程序和过长的制作周期,目前已有许多研究人员选择使用冰冻切片技术制片后对植物组织细胞进行观察研究。

　　使用冰冻切片技术对温州、海南两种产地的温郁金（Curcumawenyujin）根茎进行切片,制成临时装片后对其显微结构进行研究对比,结果显示使用冰冻切片法制成的切片组织结构清晰,其横切面显微结构层次分明,并可清晰地分辨出不同细胞的排列方式及形态特征（刘培卫等2017）。

利用冰冻切片法对海滨锦葵（Kosteletzkyavirginica）的根、茎、叶和花器官进行切片,均观察到了完整而清晰的海滨锦葵各器官组织细胞结构,表明冰冻切片技术可应用于植物的不同组织器官且能获得质量较高的切片（李贺等2010）。

除观察显微结构外,将麦冬（Ophiopogonjaponicus）根部进行冰冻切片后放入干燥器中干燥,使用离子溅射仪镀金膜后在扫描电镜下进行亚显微结构观察,也取得了不错的观察效果（谢佩松等2009）。

近年来,有研究人员利用冰冻切片中抗原分子稳定性好、活性强的特点,把免疫荧光标记方法与冰冻切片技术相结合,将甘蔗（Saccharumofficinarum）茎尖冰冻切片制片后对微管进行免疫荧光标记,得到了图像清晰、结构完整的甘蔗茎尖不同区域细胞的荧光图像,表明冰冻切片技术非常适合植物微管骨架或其他类型植物细胞的标记研究,对研究微管骨架在植物发育中的作用具有重要意义（张新成等2008）。

　　1.2、植物冰冻切片技术在组织化学研究中的应用

　　冰冻切片在制片过程中可使待测物质保持稳定,不发生流失或漂移,做到“原位原量固定”,最大程度地保存植物组织中的原有物质和结构,相比石蜡切片更适于开展植物组织化学研究。

　　1.2.1、对切片染色后进行植物组织化学定位

　　利用冰冻切片技术进行植物组织化学定位的重点是需要根据不同的观察和定位需求进行不同的染色操作。

使用冰冻切片法对蛇足石杉（Huperziaserrata）的根、茎和叶进行组织切片,用改良碘化铋钾试剂、5%氯化铁试剂分别对切片进行染色,可对生物碱和黄酮类化合物进行组织化学定位,并根据着色颗粒的分布密度和大小定性测定蛇足石杉的根、茎、叶中生物碱和黄酮类化合物的分布密度（卢婧玮等2015）。

利用生物碱自身荧光的特性,将含有生物碱的植物组织切片后直接置于荧光显微镜下观察也可根据荧光对生物碱进行定位,但植物组织中的叶绿素、木质素等物质的自发荧光可能会对生物碱荧光反应的结果产生干扰,所得结果不如改良碘化铋钾染色法（钟意欣禾等2018）。

将芥菜型油菜（Brassicajuncea）的幼嫩种子在常温下使用酸性香草醛或对二甲氨基肉桂醛溶液染色,经冰冻切片制片后可以清晰地观察到原花色素在植物组织中的分布（严明理等2013）。

此外,使用碘染液、苏丹III染液等染色试剂对切片进行染色后可对细胞后含物进行观察,如板栗（Castaneamollissima）果实中的淀粉（赵玉华等2013）、杭白芷（Angelicadahurica‘Hangbaizhi’）根部的挥发油（李博园等2020）以及种子胚乳或子叶中的蛋白质等（李建霞等2013）。

　　1.2.2、结合激光显微切割技术进行植物组织化学定位和次生代谢产物分析

　　激光显微切割技术（lasermicrodissection,LMD）是在显微镜下利用微激光束从不同的组织中快速切割、分离和纯化生物体的目标组织、细胞及其组分,然后用于细胞和分子生物学研究的一种技术（刘富裕等2019）。

近年来,激光显微切割技术逐渐受到业内研究人员的重视,在植物学中的应用也越来越广泛,主要包括植物组织化学定位和次生代谢产物分析、植物分子生物学研究、植物生长与调控等方面。

　　一般激光显微切割技术的样品制备方法主要采用石蜡切片法和冰冻切片法,但为防止所测成分的移位与流失,用于植物次生代谢产物分析和组织化学定位的样品制备均采用冰冻切片的制片方法。

在对射干（Belamcandachinensis）根茎进行组织特异性代谢产物分析和定量分析的研究中,使用冰冻切片法对射干根茎进行组织切片,通过LMD与UPLC-MS/MS结合,鉴定了26种黄酮类化合物与7种三萜类化合物,揭示了射干根茎中黄酮类化合物的分布模式:

黄酮和异黄酮等疏水化合物主要分布在木栓层中,而黄酮和异黄酮糖苷等亲水性化合物通常聚集在皮层、维管束和薄壁组织中。

另外,在对1～3年不同生长年限和采收时间的射干根茎进行各部位黄酮类成分的定量分析时发现,黄酮类化合物在各部位的含量随生长年限的提高而增加,且在10月下旬含量最高,从而验证了射干2～3年传统采收年限和秋末传统采收期的科学性（Chen等2014）。

目前,研究人员已使用此种方法对皂苷、生物碱、多糖、萜类、挥发油等多种类型的化学成分进行了定性定量分析,涉及了柴胡（Bupleurumfalcatum）、博落回（Macleayacordata）、人参（Panaxginseng）、益母草（Leonurusjaponicus）、肉桂（Cinnamomumcassia）等十余种药用植物,建立了一种新的组织化学研究方法,从而可进一步探讨中药“辨状论质”的科学内涵。

　　1.2.3、结合质谱成像技术进行植物组织化学定位和次生代谢产物分析

　　质谱成像技术（massspectrometryimaging,MSI）是一种新型分子成像技术,其原理是使用激光、电喷雾等离子化手段,将样品切片中的待测组分进行解吸与电离,通过质谱检测后获取与样品切片空间位置相关联的质谱图集合（McDonnell等2015）;具有免标记、高通量、高准确度、高覆盖率的优势,非常适合于中草药的复杂化学成分体系。

将冰冻切片技术应用于MSI的样品制备过程,是样品制片的首选方法。

需要注意的是,在冰冻切片包埋过程中使用的OCT（optimalcuttingtemperaturecompound）包埋剂会干扰样品切片中待测组分的原位解吸与电离,影响最终的成像效果,通常使用羧甲基纤维素、明胶和冰进行代替（葛均悦等2019）。

　　对芍药根冰冻切片进行质谱成像分析,揭示了没食子酰葡萄糖和单萜苷的组织特异性分布,结果显示没食子酰葡萄糖主要分布在木栓层和木质部区域,并随着没食子酰基数目的增加而逐渐集中分布于植物组织的木质部;芍药苷、氧化芍药苷等单萜苷主要分布在木栓层和皮内除木质部的大部分区域。

而白芍的加工方法为置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮,因此白芍传统的去皮加工方式可能会导致芍药苷等药效物质含量的降低（Li等2016）。

对长春花（Catharanthusroseus）茎冰冻切片进行质谱成像分析,以研究茎中萜类吲哚生物碱生物合成过程中关键中间体的组织分布特征,结果发现萜类吲哚生物碱合成的重要中间体（如catharanthine和serpentine）分布在异细胞和乳管细胞中,这对阐明长春花次生代谢产物的空间分布网络及其体内转运机制具有重要意义（葛均悦等2019）。

目前,研究人员已通过MSI对甘草（Glycyrrhizauralensis）、黄芩（Scutellariabaicalensis）、雷公藤（Tripterygiumwilfordii）等药用植物中次生代谢产物的组织分布特征进行了分析,并对银杏（Ginkgobiloba）等药用植物中多种化学成分进行了精确定位和追踪,从而揭示了这些药用植物中次生代谢产物的合成、转运路径和累计规律。

另外,通过对人参、三七（P.notoginseng）和西洋参（P.quinquefolius）三种五加科药用植物进行质谱成像分析,对其中皂苷的含量和分布进行差异比较,并以此对这三种药用植物加以鉴别,建立了一种新的药材鉴定方法（Wang等2016）。

　　1.3、冰冻切片技术在植物RNA提取、蛋白质组学以及转录物分析中的应用

　　冰冻切片技术在植物分子生物学中的应用是通过激光显微切割技术实现的,主要包括RNA提取与检测、蛋白质组学以及转录物分析三个方面。

对于分子生物学研究,样品的制备使用石蜡切片法和冰冻切片法皆可;冰冻切片法可避免生物大分子因固定剂产生交联改变结构,能提供高质量可回收的生物大分子（刘富裕等2019）。

从杨树花芽上取不同发育时期的新鲜花药进行冰冻切片,使用LMD收集花粉母细胞进行RNA的提取和检测,得到的RNA产量和质量都较高,每1000个细胞的产出量约为50ng（张文超等2013）。

利用冰冻切片技术对番茄（Lycopersiconesculentum）果实的果皮进行组织切片,使用LMD分离出外表皮细胞、厚角组织细胞和薄壁细胞进行蛋白质组学分析,共鉴定出1870种蛋白质,其中有850种是三种细胞所共有的（Liang等2018）。

在对拟南芥（Arabidopsisthaliana）的茎进行冰冻切片之后采用LMD收集维管束,提取蛋白质,然后利用二维凝胶电泳或HPLC-MS/MS进行蛋白质分析,在400个维管束（200000个细胞）中共获得了33种维管束特异表达的蛋白质（Schad等2005）。

利用LMD从白云杉（Piceaglauca）茎段的冰冻切片样品中收集皮层树脂道、形成层和整个横切面组织,使用白云杉TPS基因的特异性引物进行qRT-PCR分析,比较三个组织中参与萜类代谢基因的相对转录物丰度,发现皮层树脂道中的转录物丰度比其他两个组织中丰富12倍,推断萜类化合物的积累是在皮层树脂道中进行的（Abbott等2010）。

　　2、植物冰冻切片的条件

　　植物冰冻切片的基本步骤为:

取样处理、包埋、冰冻、快速切片、后续实验。

由于植物组织的特殊性,需要根据样品特点与后续实验需求对每一步的条件进行逐步探索。

目前,植物冰冻切片主要有两种方式:

一种是植物样品在进行固定、保护、软化等前处理后包埋切片;一种是植物样品无需进行处理,可直接取材包埋后切片。

这两种方法都可制作出清晰完整的组织切片。

　　2.1、新鲜材料直接包埋后冰冻切片

　　在进行植物冰冻切片时,可首先考虑过程最为简便、适用性最广的新鲜材料直接包埋切片。

除使用新鲜组织外,有报道将干燥的牡丹皮、黄柏、防风等药材湿润软化后进行冰冻切片,发现使用干燥药材制作冰冻切片效果良好,与使用新鲜药材并无明显差别（宗玉英等2004）。

在直接包埋切片的过程中,需要对冰冻切片包埋剂、冷箱温度与样品头温度、包埋后冷冻时间、切片厚度进行筛选,其中冷箱温度与样品头温度、包埋后冷冻时间以及切片厚度的选择是新鲜材料直接包埋切片成功与否的关键。

　　2.1.1、冰冻切片包埋剂

　　在植物冰冻切片中,包埋剂主要起到将植物样品固定在样品托上的作用。

冰冻切片包埋剂主要有OCT包埋剂、TFM（tissuefreezingmedium）包埋剂、普通胶水等（张建逵等2013）,这三种包埋剂都是大分子水溶性混合物。

在对杨树和杉木茎段组织的冰冻切片技术研究中使用普通胶水代替OCT包埋剂进行冰冻切片,发现胶水冻结后比OCT包埋剂略硬,但切片效果差别不大,且普通胶水价格低廉、购买方便。

如果切片是用来观察细胞组织结构,则可以用普通胶水代替前两种包埋剂;但如果切片后需要进行植物化学成分和生物分子的提取鉴定,则应使用OCT或TFM包埋剂,避免普通胶水中其他杂质的干扰与污染（陆叶等2009）。

　　2.1.2、冷箱温度与样品头温度、包埋后冷冻时间以及切片厚度的筛选

　　大部分冰冻切片机都有冷箱温度和样品头温度两种温度可以调节。

在植物冰冻切片中这两种温度相差不大,最好使样品头温度比冷箱温度高2～3°C,否则可能会因为冷箱温度较高而卷片,致使无法贴片（李建霞等2013）。

在切片过程中冷箱温度与样品头温度一般控制在-25～-15°C,包埋后冷冻时间一般控制在10～30min。

温度太低或冷冻时间太长会导致组织过硬切片易碎,温度太高或冷冻时间不够包埋剂无法完全凝结,切片困难。

在切片过程中如果总是出现切片易碎的情况,可以对切片进行“回温”操作,即在到达冷冻时间后,将切片放置在室温下10～30s,使其略微软化,有利于获得结构完整的切片（陈晓鹭等2016）。

在切片厚度的设置上要综合考量切片质量与切片难易程度两种因素,通常切片越薄则切片质量越高,但组织细胞容易破碎,切片难度较大。

花、叶片、茎尖等较为幼嫩的组织切片可以较薄,一般为5～20μm;根、茎等含水量较低、硬度较大的组织切片可以稍厚,但最好不超过40μm,否则切片透明度很差,为后续实验的进行带来困难。

　　在板栗果实冰冻切片条件的筛选中,从组织切片的抗卷度、厚薄度、完整程度及显微观察效果四个方面进行分析,分别对冷箱温度、冷冻时间、切片厚度进行单因素考察,并在此基础上进行L9（34）正交试验,结果显示在冷箱温度-20°C、冷冻时间20min、切片厚度4μm的条件下,切片品质最好;并且在冷冻结束后,将固定好的包埋块在室温下回温10s,切片过程更易进行（赵玉华等2013）。

使用新鲜的艾纳香（Blumeabalsamifera）叶进行冰冻切片,考察不同冷箱温度、冷冻时间和回温时间对切片效果的影响,最终确定为冷箱温度-18°C、冷冻时间10min、回温30s为最佳切片条件,获得了完整清晰的组织切片（陈晓鹭等2016）。

将新鲜的博落回根在冷箱温度-20°C、切片厚度30μm的条件下进行冰冻切片,得到了完整清晰组织切片,并结合LMD研究了博落回根中生物碱的组织化学定位（左姿等2016）。

使用冷箱温度-18°C、样品头温度-15°C、冷冻时间30min、切片厚度10～15μm的切片条件对旱柳（Salixmatsudana）子房、大叶黄杨（Buxusmegistophylla）花进行冰冻切片,结果显示植物组织结构完整,细节清晰（李建霞等2013）。

但是在冷箱温度和样品头温度为-24～-22°C、切片厚度50或100μm的条件下对杨树（Populusprzewalskii）和杉木（Cunninghamialanceolata）茎段直接包埋切片,切片破碎较为严重,效果不理想（陆叶等2009）。

在冷箱温度和样品头温度为-20～-18°C、切片厚度10～16μm的条件下对木薯（Manihotesculenta）叶片、块根等组织直接包埋切片,也未得到完整清晰的组织切片（刘雪辉等2014）。

这些实验结果的差异可能是因为切片条件选择不当且没有进行回温操作导致的。

　　2.2、新鲜材料经前处理后冷冻包埋并切片

　　当使用新鲜材料直接切片的方式始终无法得到清晰完整的组织切片时,在实验内容允许的情况下,可考虑将样品经前处理后再包埋切片。

样品切片的前处理主要有固定、保护和软化三个步骤,并可根据不同的实验情况对这三项进行取舍与合并,在切片时同样需要对包埋剂、冷箱温度与样品头温度、包埋后冷冻时间、切片厚度进行选择与优化。

　　2.2.1、样品的固定与保护

　　用于冰冻切片的固定液与石蜡切片类似,有FAA固定液、多聚甲醛、丙酮等,不同种类的固定液固定的材料后续切片条件也有所不同。

常用的冷冻保护剂有蔗糖和甘油,可与组织细胞中的自由水结合,起到减轻细胞“冰晶损伤”的作用;一些组织固定液如FAA固定液的凝固点较低,也可作为冷冻保护剂使用（张建逵等2013）。

样品的保护通常在固定后进行。

在进行样品的保护处理时要注意考察冷冻保护剂的浓度,植物组织的含水量与冷冻保护剂浓度成正比,但一般控制在5%～20%范围之内,浓度过高则细胞易收缩变形发生质壁分离,浓度过低则达不到冷冻保护的效果。

除使用冷冻保护剂外,将处理过的样品放入液氮中速冻20～60s后再进行包埋切片,也可防止组织细胞间形成大冰晶,起到冷冻保护的作用（陈丹等2005）。

　　使用FAA固定液将麦冬根部固定后于-20°C冷冻30min进行切片,结果显示植物组织切片厚度均匀,结构完整清晰（张建逵等2013）。

将高山红景天（Rhodiolacretinii）茎与主根切成小段后投入70%乙醇中固定3h并使用10%～15%甘油作保护剂在-30°C下进行冰冻切片,得到了清晰完整的组织切片（刘剑锋等2006）。

在对杨树和杉木茎段组织的冰冻切片技术研究中发现,使用多聚甲醛固定的杨树和杉木茎段不经保护液处理直接液氮速冻50s后包埋切片效果更好,而使用丙酮或卡诺固定液固定的茎段经10%蔗糖保护后切片质量更高（陆叶等2009）。

在对蝴蝶兰（Phalaenopsisaphrodite）花器官进行冰冻切片的实验中,对子房、花瓣、唇瓣和合蕊柱的冰冻切片最适蔗糖浓度进行了研究,最终确定了子房的最适蔗糖浓度为4%,花瓣为8%,唇瓣为4%,合蕊柱为16%;并将蔗糖处理过的样品在液氮中速冻30s后再进行包埋切片,获得了清晰且完整的组织切片,建立了蔗糖保护-液氮速冻的冰冻切片方法（陆振芳等2019）。

但是液氮速冻作为一种比较极端的处理方法,会导致细胞出现严重的质壁分离现象,损害亚显微结构（宁代锋等2008）,因此在实验中应酌情使用。

对于一些含水量较多的幼嫩组织可以使用液氮速冻法进行尝试,但如果在实验中需要观察细胞的亚显微结构,则不能使用液氮速冻法。

　　2.2.2、样品的软化

　　对于木质化程度较大的植物组织器官,由于质地较硬难以切片,因此需要进行软化处理。

冰冻切片中的软化剂主要为甘油。

同冷冻保护剂一样,软化剂的浓度也应根据材料的硬度有所变化,一般控制在5%～20%之间。

甘油浓度小于5%则软化效果不好且组织细胞会因含水过多导致切片易碎,甘油浓度大于20%则过于黏稠,同时甘油作为冷冻保护剂过低地降低了组织细胞的凝固点,导致切片困难。

牛膝（Achyranthesbidentata）、南苜蓿（Medicagopolymorpha）等植物的果实硬度较大难以成片,尝试将材料固定后使用15%甘油软化处理3h后切片,结果显示使用甘油软化后的材料容易成片,切片效果较好。

根据研究经验,当植物材料较软时,甘油浓度5%～10%较为合适;当材料较硬时,可将甘油浓度提升至15%（李儒海等2010）。

　　2.2.3、切片时条件的选择与优化

　　新鲜材料经前处理后切片的包埋剂、冷冻温度、包埋后冷冻时间以及切片厚度的选择与优化方法和新鲜材料直接包埋切片相同,但需要注意的是如果在前处理过程中使用了液氮速冻,则必须在切片前将植物组织放入冷箱内进行1～2h的回温,否则植物组织温度太低,硬度太大,极易破碎。

　　3、总结与展望

　　冰冻切片简便易操作,能很好地保存组织细胞内的次生代谢产物和生物分子,不论是用于组织细胞观察、组织化学研究还是分子生物学研究,冰冻切片都是一种简单有效的样品制备方法。

对于植物冰冻切片的两种切片方式,其中样品经过前处理的切片方式要综合考量固定剂、冷冻保护剂、冷冻时间、温度等多种因素,处理环节多且复杂,对于新接触冰冻切片者难度较大。

新鲜材料直接切片可以根据植物样品特点筛选合适的条件直接包埋切片,从而得到细胞结构清晰完整的组织切片,避免了细胞结构的损害和成分的流失,是一