硕士论文过渡元素与血红蛋白的作用及其结构研究.docx
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硕士论文过渡元素与血红蛋白的作用及其结构研究
目录
中文摘要………………………………………………………………………i
Abstract………………………………………………………………………ii
第一章综述
前言………………………………………………………………1
第一节蛋白质同金属离子的相互作用研究进展…………………1
1.1.过渡元素与蛋白质的相互作用………………………3
1.2.稀土离子同蛋白质的相互作用………………………3
1.3.贵金属同蛋白质的相互作用…………………………4
1.4.重金属与蛋白质的相互作用…………………………5
1.5.其它情况………………………………………………5
第二节稳定常数测定………………………………………………6
第三节蛋白质的结构研究………………………………………7
3.1红外光谱……………………………………………8
3.2核磁共振……………………………………………10
3.3拉曼光谱…………………………………………11
3.4X-ray衍射…………………………………………11
3.5电子晶体学…………………………………………12
参考文献……………………………………………………………………13
第二章过渡金属与血红蛋白的相互作用
第一节实验部分…………………………………………………19
1.1仪器、试剂及实验条件……………………………19
1.2实验方法……………………………………………19
第二节结果与讨论………………………………………………21
2.1温度的影响…………………………………………21
2.2反应时间的影响…………………………………21
2.3平衡常数测定………………………………………22
2.4红外光谱结构测定…………………………………24
参考文献……………………………………………………………………28
第三章贵金属与血红蛋白的相互作用
第一节实验部分…………………………………………………30
1.1仪器、试剂及实验条件……………………………30
1.2实验方法……………………………………………30
第二节结果与讨论………………………………………………31
2.1电子能谱研究………………………………………31
2.2红外光谱解析………………………………………33
2.2.1.血红蛋白的红外谱解析……………………33
2.2.2.络合物的红外光谱解析……………………36
第三节结论………………………………………………………38
参考文献……………………………………………………………………39
第四章贵金属同过渡元素与血红蛋白作用的红外光谱研究
第一节实验部分…………………………………………………41
1.1仪器、试剂及实验条件…………………………41
1.2实验方法……………………………………………41
第二节结果与讨论………………………………………………42
2.1血红蛋白的红外谱解析……………………………42
2.2AuCu-Hb络合物的红外光谱解析…………………42
2.3PtNi-Hb络合物的红外光谱解析…………………44
2.4IrCo-Hb络合物的红外光谱解析…………………46
第三节结论………………………………………………………49
参考文献……………………………………………………………………50
附录
已发或待发文章
致谢
摘要
本文主要研究了牛血红蛋白（Hb）与多种金属离子相互作用的平衡常数及所生成络合物的结构。
用ICP-AES测定，根据Langmuir方程：
ni/（ns-ni）=KC，作图计算了Cu2+与Hb结合的平衡常数（K）及Zn2+、Ni2+存在下对Cu2+与Hb结合平衡的影响，并用FTIR光谱对Hb及其金属络合物的结构进行了对比研究。
结果表明，Zn2+对K的影响较大，使K值从3.461×103l/mol变为2.198×103l/mol，Ni2+的作用不很明显，Ni2+存在时的K值为3.208×103l/mol,且Zn2+的结合使Hb的构象发生了很大变化。
另外，采用电子能谱技术研究了单核贵金属血红蛋白络合物中配位原子键合能的变化，并运用去卷积曲线拟合FTIR技术对固态Hb及其贵金属络合物红外酰胺I带（1700-1600cm-1）中二级结构的各个成分进行了定量分析，对酰胺II带（1600-1500cm-1）中二级结构的各个成分进行了初步指认。
结果表明，Hb中的α-helix（1646.31cm-1）含量为71.0%，不含β-sheet结构，其它组分含量为29.0%，其中主要是转角结构（1691.43cm-1），这与X-ray分析结果及FTIR测定水溶液、重水溶液或CDCl3溶液中的Hb得到的结果相一致。
贵金属与Hb的作用对Hb结构的影响基本一致，均使α-helix含量减少，尤其是Au3+和Pt4+的作用更为相似，Ir4+同Hb的作用使Hb中α-helix减少的同时增加了其中的β-sheet成分，且Co2+与Ir4+之间存在一定程度的协同作用，两种离子共存时促进了Hb的结构从α-helix到β-sheet的转变；而Au3+与Cu2+之间存在拮抗作用，Cu2+的存在对Au3+与Hb的结合有抑制作用；Pt4+的存在并没有使Ni2+与血红蛋白的作用增强，Ni2+的存在对Pt4+与血红蛋白的作用也影响不大。
Abstract
Inthisarticle,theinteractionofmetalionswithbovinehemoglobin（Hb）wereinvestigated,theequilibriumconstantKofCu2+withbovinehemoglobinandtheinfluenceofZn2+andNi2+tothebindingprocessofCu2+withHbweredetermined.TheconformationalchangesofHbanditsmetalcomplexeswerediscussedbyusingFTIR.ItwasfoundthattheinfluenceofZn2+toKislarge,Kischangedfrom3.461×103l/molto2.198×103l/mol，buttheinfluenceofNi2+toKislittle,Kischangedto3.208×103l/mol,andthestructurechangeisverylargeintheexistenceofZn2+.
TheligandbindingenergychangesofthecomplexesofAuHb、PtHb、IrHbwereinvestigatedbyusingX-rayphotoelectronspectrometry（XPS）.Inaddition,thequantitativesecondarystructureconformationalanalysisofHbandallnoblemetalcomplexesinsolidstate,basedonfouriertransform-infrared（FTIR）self-deconvolutionandcurve-fittingproceduresoftheamideIbandregion（1700-1600cm-1）wasinvestigated,theresultis71.0%α-helix（1646.31cm-1）andnoβ-structureinHb,whichareinaccordancewiththeresultsofX-rayandFTIRinaqueous、D2OorCDCl3resolution.AndthequalitativesecondarystructureconformationalanalysisofamideIIbandregion（1600-1500cm-1）wasalsoinvestigated.Theinteractionofnoblemetalionswithhemoglobinissimilar,particularlyforAu3+andPt4+,majorconformationalchangesisthedecreaseofα-helix.ForCoHb、IrHb、IrCo-Hbcomplex,majorconformationalchangesarefromα-helixtoβ-sheet,andtheinteractionofCo2+andIr4+withHbiscoordinative,butforAu3+andCu2+isin-coordinative,andthereisnocoordinationofPt4+andNi2+withHb.
第一章综述
前言
众所周知，蛋白质是生命机体所必不可少的生命基础物质，是生命机体进行各种生理活动的主要承担着。
蛋白质种类繁多，目前已经发现的蛋白质数量已达几百万种，但是各种蛋白质均是含有多个配位原子（如：
N、O、S，有些蛋白质还含有P等）的大分子多齿配体，因此能够很容易地与金属离子或其小分子配合物相互作用。
蛋白质的功能与其结构构象密切相关，有什么样的结构就有什么样的功能，反之亦然。
蛋白质某种生物功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关；同时，蛋白质某种生物功能或活性的减弱或消失也往往是受某种沾染元素或有害元素的影响，这些元素大多数是金属元素，它们通过与相关蛋白质的作用来稳定或改变蛋白质的结构构象，从而达到控制或影响蛋白质功能的目的。
因此可以说，研究金属元素同蛋白质的相互作用特别是多种不同金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质结构构象的变化，阐明某种金属元素的作用机理，从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响、预防中毒及环境污染治理等有重要意义。
蛋白质与金属离子相互作用的研究早在50年代就已开始进行。
自60年代以来，采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋白和金属酶的结构，配合生物活性研究推测了它们的作用机理，这些研究构成了生物无机化学的主要研究方面。
80年代以来，各种检测技术及计算机技术的发展为人们研究蛋白质同金属离子的相互作用打开了一个新的局面，这方面我国的生物无机化学家王夔[1]、申泮文[2-4]等已作了大量的研究工作，并有多部相关专著。
第一节蛋白质同金属离子的相互作用研究进展
蛋白质自身结构及配位环境的复杂性决定了蛋白质同金属离子相互作用的复杂性。
蛋白质可以与金属离子直接作用形成络合物，也可以与金属小分子配合物发生配体交换反应或加合反应，若是含金属的蛋白质，也可发生金属离子之间的置换反应，这在重金属中毒方面尤为常见。
金属离子常充当蛋白质构象变化的诱发因子，而且同种金属离子或不同金属离子之间常存在不同程度的协同拮抗作用，且对不同的蛋白质这种作用的方式和程度是不同的。
对同种金属离子来说，一个离子的结合引起蛋白质构象发生变化，使蛋白质的紧密结构趋于松散状态，可能裸露出更多的结合部位而引发更多金属离子的结合，从而引起整个蛋白分子构象的变化。
最突出的例子是钙触发蛋白，它的触发活性表现在细胞内钙离子浓度的变化迅速影响蛋白质的构象和组装，这一全过程包括钙离子结合在两螺旋结构之间有一定柔性的结构部分上引起运动，这种运动规模较大，而且可以通过蛋白链传递下去，引起整个分子构象的巨大变化。
蛋白质分子中不同配位原子或不同位置的相同配位原子的配位能力也是不同的，它们的空间位置是否与金属离子的配位构型相一致，以及它们在大分子中所占位置是否对向其进攻的金属离子开放等条件都决定了金属离子只能在一定位置的几个功能基团上形成稳定结合。
金属离子同蛋白质的相互作用除受蛋白质本身刚性和柔性结构影响外，还受金属离子电荷、半径、配位构型等因素影响，如Zn常与Cys、His以配位键形成四面体结构。
另外，反应温度、反应时间、离子浓度（强度）、酸度、缓冲液等均影响蛋白质与金属离子的相互作用。
特别值得注意的是离子浓度对反应的影响，浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围。
由于蛋白质种类繁多，且某些蛋白质的提取、分离、纯化十分困难，价格昂贵，因此目前研究的较多的是一些常见的蛋白质，如：
血红蛋白、血清白蛋白、肌红蛋白、伴清蛋白等及一些金属蛋白（钙调蛋白、铜蛋白等），以及一些植物蛋白，如：
天花粉蛋白等。
对一些常见的生命元素及稀土元素研究较多，对贵金属元素主要侧重于有抗癌活性的顺铂类小分子配合物与蛋白质相互作用的机理研究上；对重金属而言，重金属元素同蛋白质、特别是同血液中蛋白质的相互作用及同正常生命元素与蛋白质的竞争结合、置换作用等的研究已有不少文献报道[5-8]。
1.1.过渡元素与金属离子的相互作用
人们对过渡元素同金属离子的作用研究较多，其中研究得最多的是Cu、Zn、Ni、Mn等，蛋白质中研究得最多的是血清白蛋白（HSA和BSA）、肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb），一些过渡金属离子与蛋白质的作用见下表（表一）。
表一.过渡元素与金属离子的相互作用
元素
蛋白质
研究方法
参考文献
Cu
家蚕丝蛋白、BSA、HSA、Hb
紫外可见光谱、ESR、X-ray、紫外、荧光
9-12
Zn
BSA、HSA
氨酰传递RNA合成酶
紫外、荧光、EXAFS
荧光、平衡透析
13-16
Ni
BSA、HSA、Hb
荧光
17-19
Co
BSA、HSA、Hb、Mb
金属硫蛋白
紫外可见光谱
NMR、X-ray
20-25
Mn
BSA、HSA、Hb
叶绿体光获蛋白
平衡透析
FTIR
26-27
Cd
BSA、HSA
PSII蛋白质
平衡透析
FTIR
28-29
V
Hb
荧光
30
1.2.稀土离子同蛋白质的相互作用
稀土离子因与钙离子性质及半径相似，且电荷高，离子势大，对以离子键为主的化合物来说，结合稳定性高于钙，它能够占据或取代钙的位置而影响一系列的生物功能；此外，稀土离子因具有4f电子而能产生一系列的光磁效应，是蛋白质化学研究中的主要探针；而钙离子是一种重要的生命元素，对于维持细胞正常功能、肌肉收缩、信息传递、神经冲动传导及骨骼的形成等起着十分重要的作用，因此研究稀土离子同蛋白质的作用尤其是同含钙蛋白质的作用十分重要，这方面已有很多的研究报道（见表二）。
表二.稀土离子与蛋白质的相互作用
蛋白质
研究方法
参考文献
钙调蛋白
红外光谱（IR）
31-35
肌动蛋白
CD、UV差光谱
36-38
铁传递蛋白
穆斯堡尔谱
39-40
免疫球蛋白
质子驰豫加强、EPR
41-42
伴刀豆球蛋白A
核磁驰豫研究、荧光
43-44
肌红蛋白
Raman光谱
45
HSA、BSA
UV、IR、CD、NMR、荧光
46-48
血红蛋白Hb
NMR、荧光
49-50
α-球蛋白
质子驰豫加强
51
牛血Cu（Zn）-SOD
ESR、CD、荧光
52
1.3.贵金属同蛋白质的相互作用（表三）
表三.贵金属与蛋白质的相互作用
贵金属
蛋白质
研究方法
参考文献
六氯合铂酸钾
金属硫蛋白
紫外、电子能谱、CD
53
顺二氨二水合铂
膜蛋白、膜膦脂
荧光
54
顺二氯二氨合铂
红细胞膜蛋白
ESR
55
顺铂、反铂
红细胞膜糖蛋白
荧光、电泳、CD
56
顺铂
F-肌动蛋白
LMCT谱
57
Ag-Cu
血红蛋白
IR、Raman
58-59
Fe-Ru
血红蛋白
NMR
60-62
1.4.重金属与蛋白质的相互作用
在重金属与蛋白质的相互作用研究中，研究得最多的是Hg、Pb与各种蛋白质特别是血液中的蛋白质的相互作用[63-67]，这种相互作用往往是金属离子同蛋白质的络合或取代其中的有益元素。
除金属离子本身外，一些阴离子配合物，如：
HgCl42-、HgBr42-、HgI42-或Hg（SCN）42-也与蛋白质结合，这可能是由于配合物的离解，如HgI42-离解产生HgI3-、HgI2和I-，反应可能通过一非电荷体系进行，或者这些阴离子基团与蛋白质上的特定部位发生静电相互作用或范德华力作用等。
Steinberg和Sperling[68]还指出汞原子可能插入胱氨酸的二硫键Hg22++RSSR=2（RSHg）+=RSHgSR+Hg2+，通过破坏二硫键来改变蛋白质的结构。
NaharS[28]等人研究了二价Cd、Hg、Pb与PSII富集膜蛋白的相互作用，用去卷积二阶导数FTIR差异光谱研究了金属蛋白质相互作用的本质及形成金属络合物后蛋白质的构型转变和结构变化。
结果表明，低离子浓度时无金属离子与蛋白质的主要相互作用；高浓度时，观察到金属离子结合在蛋白质中酪氨酸残基的C=O和C-N基团上，同时还可观察到汞与硫的结合，主要构型转变是从未配位蛋白质的64%的α螺旋和10%的β折叠到络合物的55-40%的α螺旋和10-20%的β折叠。
1.5.其它情况
一些主族元素如Ca、Mg、Na、K、Al等与蛋白质相互作用研究的报道也很多[69-72]。
此外，血红蛋白是一种价格便宜、制备简单的重要蛋白质，在体内血浆中担负着吸氧输氧功能。
Perutz等对血红蛋白的结构构象研究很深，弄清楚了血红蛋白吸氧脱氧的机理及其对血红蛋白结构的影响，以及血红蛋白的Bohr效应等。
对血红蛋白双核金属杂化物的研究近年来已有不少报道（见表四），主要是各种不同的过渡元素取代Hb亚单元中的部分Fe从而生成双核Hb杂化物，并采用X-ray、NMR、EPR等手段进行了结构测定及杂化物吸氧平衡研究。
表四.血红蛋白双核杂化物的研究
金属元素
研究方法
参考文献
Ni-Fe
X-ray
73-74
Mn-Fe
FTIR
75-76
Mg-Fe
X-ray
69,77
Co-Fe
X-ray、EPR、Raman
78-79
Zn-Fe
X-ray
80-81
Cu-Fe
EPR
82
Ru-Fe
NMR
60
Co-Zn
EPR
21
第二节稳定常数测定
在金属离子与蛋白质的相互作用研究中，金属离子在蛋白质上的结合量、结合部位及反应稳定常数的研究也是十分重要的。
对结合量的测定常采用光度法、ICP、AAS等手段来进行；结合部位的测定可采用氨基酸残基修饰法、离子探针法及紫外、拉曼光谱等手段检测某些有特定波长吸收峰的氨基酸残基的波长变化等，还可通过稳定常数对介质pH值的依赖关系来判断，如金属结合蛋白的稳定常数在pH5.6-7.0范围内突然变化，就表明金属结合的部位有组氨酸残基。
对结合量的测定，特别是不同离子浓度结合蛋白质后结合量的测定是研究稳定常数的基础，对金属结合蛋白质的稳定常数测定同普通的金属离子——配体体系基本相同。
这方面申泮文等人做了大量工作[2-4]，采用平衡透析法对Cu、Zn、Ni同HSA、BSA相互作用的稳定常数及共存离子对稳定常数的影响进行了深入研究，结合Adair方程、Scatchard作图法及非线性最小二乘法拟合Bjerrum函数等方法处理数据，同时用Hill系数来定量分析了Ni同HSA、BSA中多个结合部位之间的协同性，发现Hill系数同样是”S”形曲线，对两体系Ni（II）-HSA和Ni（II）-BSA来说，hmax分别为1.6和1.5，这表明两体系都存在较强的正协同效应；并对大量Cu2+、Ca2+存在下Ni2+与HSA、BSA的结合干扰作了分析[17]，结果表明，Cu2+的存在对Ni2+的结合有明显的拮抗作用，而Ca2+的存在对Ni2+的结合影响不大。
张保林等[46]用离心超过滤法研究了La等11种稀土离子与BSA相互作用的结合数据，按照Taria方程处理，得到专一性结合常数Ks和非专一性结合常数Kns及专一性结合部位数ns，并将Ks、Kns分别和相应的稀土离子与二元、一元羧酸形成配合物的稳定常数的大小变化规律作了比较，结果表明lgKs随稀土系列原子序数ZRE的变化存在明显的”四分组效应”，而lgKns对ZRE的关系与稀土——乙酸配合物稳定常数随ZRE的变化规律极其相似。
金属离子在蛋白质上的结合部位及结合类型的研究也往往贯穿于稳定常数的测定过程中，但是，由于蛋白质分子的多配位性导致金属离子结合蛋白质时的复杂性，而且在此过程中还伴随着蛋白质的构象变化，这都增加了稳定常数测定过程中的不确定性因素。
到目前为止，尚没有一种理想的方法象研究金属小分子配体体系一样来准确的对金属离子结合蛋白质的稳定常数进行定量分析。
第三节蛋白质的结构研究
对蛋白质结构的研究一直是蛋白质研究领域人们所关注的焦点，但直到1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang第一次提出蛋白质三级结构的概念，才使蛋白质的结构研究走上了正确的道路，随后英国晶体学家Bernal于1958年提出了蛋白质的四级结构。
近年来，随着蛋白质结构研究技术的发展，蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构层次，即超二级结构和结构域，超二级结构是由Rossmann于1973年提出的，是指两个或多个二级结构单元进一步组合成的有特殊几何排列的局域空间结构，结构域是由免疫化学家Porter提出的，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。
近年来，随着生物技术及各种分析测试技术的进步，对蛋白质结构的研究也有了很大发展。
如血红蛋白的四级结构含α1、β1、α2、β2四个亚单元（图1）。
在蛋白质结构的研究中，红外、紫外、拉曼、荧光、圆二色性、X-射线晶体衍射、核磁共振和电子晶体学等均有广泛应用，另外诸如穆斯堡尔谱[39]、旋光色散（ORD）、磁圆二色性（MCD）、电子顺磁共振（EPR）、磁化率等手段在蛋白质的结构研究方面亦有报导[83-86]。
由于蛋白质中含有芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp），其次是苯丙氨酸（Phe），它们在280nm附近产生吸收，因此可利用紫外-可见光谱研究蛋白质的结构。
蛋白质由于具有不对称碳而具有光学活性，通过对蛋白质园二色谱的测定和计算可了解蛋白质在溶液状态下的二级结构，从而可检测一些反应引起的构象变化。
而荧光分析法主要是运用荧光探针技术对蛋白质的疏水区、氨基状态、二硫键等进行检测，也可测定蛋白质的二级结构变化及其变构效应。
下面就几种主要的研究方法及其进展加以介绍。
3.1红外光谱
红外光谱是研究蛋白质二级结构的主要手段之一[87-100]，它既可以对蛋白质的二级结构进行定性分析，也可以进行定量分析。
1950年Elliott和Ambrose根据模型多肽提出的红外酰胺I带1660~1650cm-1的峰属α螺旋结构、1640~
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