心脑血管药理食管癌放疗增敏.docx

心脑血管药理食管癌放疗增敏.docx

《心脑血管药理食管癌放疗增敏.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《心脑血管药理食管癌放疗增敏.docx（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

心脑血管药理食管癌放疗增敏

《分子生物学》作业整理

第2-4章基因组学、蛋白质组学、基因工程

一、名解

1、什么是SNP？

试述研究SNP的意义。

（1）SNP（P23）（SingleNucleotidePolymorphisms，单核苷酸多态性）：

SNP是由基因组DNA上的单个碱基的变异（包括置换、颠换、缺失和插入）而引起的DNA序列多态性。

【在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。

一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。

据估计，人类基因组中每1kp就存在一个SNP位点，共有约300万个之多，是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性。

大多数SNP位点十分稳定，人类85%的SNP是共有的。

】

（2）研究SNP的意义：

①具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。

寻找疾病相关的突变位点，以防治疾病。

②研究SNP本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。

通过对药物靶点个体差异性分析，个性化药物、方法治疗。

SNP可以作为新的“遗传标志”,人体许多表型差异、对疾病的易感性或抵抗力、对药物的反应性等都可能与SNP有关。

③法医学研究。

人类基因组是一个结构十分稳定的体系，同时又是一个变异的体系。

除同卵双生子外，没有两个个体基因组是完全相同的。

④器官移植中供体/受体配对分析。

预测启动子SNP位点与转录因子结合的改变,

编码区SNP对蛋白质的空间结构,生物功能的影响等。

⑤人类基因组计划。

人类基因组单体型图谱的逐渐绘制完成,提供了详尽的人类DNA序列的变异信息,对人类个体遗传背景的研究提供了强大的机遇和挑战。

2、ORF（P12）OpenReadingFrame，开放阅读框架）：

在DNA链上，从蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。

3、调节基因（P12）（regulatorygene）：

指某些可调节、控制结构基因表达的基因。

其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。

二、问答

1、请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。

（P32）?

答案一：

基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程。

通过样品制备、样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析、扣点、酶切、点靶和MALDI-TOF蛋白质鉴定等一整套技术手段，以获得蛋白质性质数据。

双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）原理：

利用蛋白质的等电点与分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。

第一向为等电聚焦（Isoelectricfacusing，IEF）电泳，用pH值呈梯度排列的凝胶,分离等电点不同的蛋白质。

第二向为十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），它是按蛋白质分子量的大小进行分离。

由于带负电荷的SDS可与蛋白质多肽链结合,掩盖了蛋白质原有的电荷差别,故可分离分子量不同的蛋白质。

流程：

样品制备。

样品来源：

细胞、组织、体液等。

可采用全蛋白,或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜蛋白、核蛋白等），以提高低丰度蛋白质的上样量及检测灵敏度。

【注意：

尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分辨率。

】

样品分离。

双向凝胶电泳（2-DE）

第一向：

等电聚焦IEF；第二向：

SDS-PAGE

蛋白质染色。

①考马斯亮蓝染色②银染（不含戊二醛）

③荧光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素标记等

微量测序（microsequencing）。

N-末端Edman降解：

经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上→N-末端氨基酸残基经苯异硫氰酸酯修饰→从多肽链上切下修饰的残基→再经层析鉴定→余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。

质谱分析（Massspectrometry）。

基本原理：

样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分子量。

主要质谱类型：

①MALDI-TOF-MS:

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry）②ESI-MS:

电喷雾质谱（electrosprayionisationmassspectrometry）

鉴定与注释蛋白质。

①通过肽质指纹图谱（peptidemassfingerprint,PMF）和数据库搜寻匹配。

②通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配。

目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。

答案二（摘自刘银坤.专家答疑）:

蛋白质组学的基本技术流程主要为以下四方面：

（1）蛋白质标本的制备及分离。

尽可能完全地抽提细胞或组织中的全部蛋白质。

【由于不同细胞或组织中疏水性蛋白质,低丰度蛋白质、高丰度蛋白质、极性蛋白质等共存，很难用单一抽提液和方法将不同细胞或组织中全部蛋白质完全制备出。

需要不断改进现有方法和寻找新方法。

】

（2）蛋白质图像的差异对比分析。

基于双向电泳（2-DE）所获得的凝胶图谱，可用图像分析软件进行分析比对；而基于双向液相层析-质谱分析（2DLC-MS）所获得的图谱的分析比对,则可发现差异性表达的分子。

（3）差异蛋白肽段的鉴定。

运用基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF）和电喷雾质谱（ESI-MS）对差异点进行蛋白质的肽段鉴定分析,可以获取肽段的质荷比（m/z）而进行进一步的分析。

（4）蛋白质数据库的搜索分析。

通过搜索蛋白质数据库可分析和确定该蛋白质的性质特征,若搜索不到,可能为新蛋白。

2、√简述酵母双杂交技术的原理。

（P41）

酵母双杂交技术是基于对真核生物调控转录起始过程的认识，典型的真核转录因子都含有二个结构域:

DNA结合结构域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）。

二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具有完整的转录因子活性。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定探测待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：

（1）与BD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称诱饵蛋白（baitprotein）。

（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）。

（3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，而菌株则具有相应的缺陷型。

当两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因，通过功能互补和显色反应筛选阳性菌落，再将酵母菌株的靶蛋白载体分离，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析。

酵母双杂交技术的应用：

①发现新的蛋白质和蛋白质新的功能；②在细胞内研究抗原与抗体的相互作用；③筛选药物的作用位点，研究药物对蛋白质之间相互作用的影响；③建立基因组蛋白连锁图。

3、分子克隆技术包括哪些基本步骤？

目的基因和载体连接主要有哪些方法？

（P57-P58）

（1）分子克隆的基本步骤：

①目的基因的获取②载体的选择③目的基因和载体的酶切与连接④重组DNA导入受体细胞⑤重组体的筛选和鉴定。

即分、切、接、转、筛过程：

分-——分离目的基因；切——限制酶切割目的基因与载体；接——拼接重组体；转——转入受体菌；筛——筛选重组体

目的基因和载体连接的方法主要有：

①粘性末端连接②平末端连接法③通过同聚尾连接

4、简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

（P47-P50）

（1）常用的工具酶：

1）限制性核酸酶内切酶2）DNA聚合酶3）DNA连接酶4）碱性磷酸酶5）核酸酶S1

对应作用：

限制性核酸内切酶（RE）：

是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。

其主要用途有：

①在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段；切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。

②分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。

③用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。

DNA聚合酶。

DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段。

Klenow片段的主要功能有：

①补齐双链DNA的3＇末端，同时可使3＇末端DNA标记同位素；②在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；②DNA序列分析。

TaqDNA聚合酶。

用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

逆转录酶。

其主要功能有：

①逆转录作用；②）核酸酶H的水解作用；③依赖DNA的DNA聚合酶作用。

末端脱氧核糖核苷酰转移酶。

其功能主要有：

①在载体或目的基因3＇末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。

②用于DNA3＇末端的同位素探针标记。

3）DNA连接酶。

其主要功能：

催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5＇磷酸基团与3＇羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA体外重组。

4）碱性磷酸酶。

其主要用功能：

①除去DNA片段上的5＇磷酸，以防自身连接；②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5＇端的磷酸。

5）核酸酶S1。

其主要作用有：

①除去双链DNA的粘性末端以产生平末端；②除去cDNA合成时形成的发夹结构；③分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。

5、举例说明载体应具备的基本要素以及双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。

（1）载体应具备的基本要素：

（P50）①能自我复制并具较高的拷贝数。

分子量一般<10Kb。

②带有遗传筛选标记。

③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。

载体上具有多个限制酶的单一位点（即在载体其他部位无这些酶的相同位点）称为多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）。

包括：

①克隆载体：

质粒载体、噬菌体载体；②表达载体：

原核细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体；③穿梭载体：

穿梭粘粒载体、酵母穿梭质粒载体。

例如质粒载体，是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，①能自我复制和表达其携带的遗传信息。

其大小为1.5-15kb。

pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。

它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），②并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。

③在这两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。

双抗生素筛选法原理（PPT77）：

某些质粒载体如pBR322质粒中装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。

蓝白斑筛选的原理（P61）:

某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶。

该酶能催化指示剂底物X-gal形成蓝色菌落。

当外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选实验。

第五章基因诊断

问答

1、列举主要的几种基因诊断技术及其应用。

（P68）

（1）常用的基因诊断技术：

1）DNA诊断：

核酸分子杂交SouthernBlotting、PCR、限制性酶切图分析RFLP、DNA测序、DNA芯片技术。

2）RNA诊断：

NorthernBlotting、RT-PCR、Real-TimePCR、cDNAmicroarray。

（2）应用：

单基因遗传病的基因诊断、感染性疾病的基因诊断、肿瘤的基因诊断以及对药物代谢和疗效的监测。

2、感染性疾病的基因诊断策略。

（P73）

（1）一般性检出策略：

针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，判断有无感染和是何种病原体感染。

（2）完整检出策略：

按照诊断→分型→亚型→耐药性检测的思路，利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行基因组测序分析，以获得更多病原体的信息。

第六章基因治疗

问答

1、基因治疗的病毒载体主要有哪几种？

各有怎样的特点？

（P89）

病毒载体对应特点

逆转录病

毒载体

（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；

（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。

腺病毒

载体

（1）宿主范围广；

（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件；（3）可获得高病毒效价；（4）重组体非常稳定；（5）不会引起肿瘤；（6）有较高的安全性；（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用；（8）不整合入染色体。

腺相关病

毒载体

（1）宿主范围广；

（2）整合到染色体中；（3）无致病性，免疫原性弱；（4）可长期表达于外源基因。

单纯疱疹

病毒载体

（1）滴度高；

（2）容量大；（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染

（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达。

痘苗病毒

载体

（1）宿主范围广泛,且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒；

（2）允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白；（3）细胞毒性，病毒能被人体的补体系统灭活并降解。

慢病毒

（HIV）载体

（1）高效感染宿主细胞，感染范围广；

（1）能逃避人体免疫系统的监视，防止免疫排斥；（3）引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒。

杆状病毒载体

（1）节肢动物为唯一宿主；

（2）能对许多哺乳动物细胞系进行高效转移；（3）在不同的细胞系中基因的表达受细胞内遗传外因子的调控；（4）具有可插入大片段，容易得到高滴度的病毒粒子和无细胞毒性；（5）经遗传修饰的病毒还具有高转导效率和较广泛的宿主范围。

2、查阅相关文献，说明基因治疗在SCID中的应用。

（1）基因治疗（GeneTherapy）:

是指将功能正常的基因导入靶细胞，以置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。

（2）SCID（SevereCombinedImmunodeficiencyDisease，严重联合免疫缺陷病）：

一组胸腺、淋巴组织发育不全及免疫球蛋白缺乏的遗传性疾病，如常染色体隐性遗传性SCID：

ADA缺乏的SCID、X连锁隐性遗传性SCID、伴白细胞减少的SCID等。

特点是遗传性性T细胞和B细胞系统异常，机体不能产生体液免疫和细胞免疫应答，通常为T细胞缺陷所致。

临床上最常见的就是ADA基因缺乏的SCID。

ADA活性缺陷性疾病为常染色体隐性遗传病。

虽然ADA编码基因也发现有缺失突变，但大部分为碱基置换突变。

ADA酶为一种能将腺苷脱氨基变为肌苷的酶。

该基因突变导致ADA活性及稳定性均降低。

ADA活性降低使腺苷水平升高，反过来又促进脱氧腺苷及dATP水平升高。

dATP升高具有毒性，尤其对淋巴细胞。

这是因为核糖核苷酸二磷酸还原酶的功能是催化DNA合成原料4种脱氧核苷酸的的合成。

而dATP是此酶的抑制剂，dATP含量增加将抑制免疫细胞中DNA的合成，做成免疫细胞发育失常。

所以正常情况下淋巴细胞具有高活性的ADA，以免受损。

ADA活性下降将使细胞损伤或死亡，致细胞体液免疫缺陷。

美国首开基因疗法之先河，1990年，科学家W·F·安德森等人首次对一例患腺甘脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁女孩进行基因治疗。

他们先分离出女孩的单个核细胞，再将含有正常ADA基因的逆转录病毒转入T淋巴细胞内，并用白细胞介素Ⅱ（IL-2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入到此患儿体内。

1~2个月治疗一次，经过18个月的治疗，该儿童的免疫力大大提高，在水痘流行期也安然无恙。

是世界上第一个基因治疗成功的范例。

1991年1月，另一名患同样病的女孩也接受了同样的治疗，获得了类似的效果。

继安德森之后，巴黎耐克儿童医院的MarinaCavazzana-Calvo博士等人也对几名X染色体连锁遗传重度联合免疫缺陷病患儿成功地进行了基因治疗。

Cavazzana-Calvo博士认为基因治疗可用于无适宜供体骨髓的X染色体连锁SCID患儿。

来自美国、意大利和奥地利的科学家们联合公布了一项关于ADA缺乏症基因治疗试验的新成果。

研究者们对10名有严重的联合性免疫缺陷症的ADA缺乏症患者进行了基因治疗，其中8名患者体内持续表达ADA，不再需要酶替代治疗，而且也没有嘌呤代谢异常的症状，9名患者T细胞数量增加，功能恢复，5名患者不再需要静脉注射免疫球蛋白来提高免疫力，并且对他们注射疫苗或抗原时可以激发出抗原特异性的抗体反应。

第七章生物分子的分离纯化

一、名解

1、荧光光度法（P117）：

将核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。

该法灵敏度高达1-5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。

2、酚抽提法（P120）：

以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。

3、碱裂解法（P123）：

在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。

4、比活（PPT63）：

指每毫克酶蛋白所具有的酶活力，一般用活力单位数/mg蛋白来表示。

比活是酶纯度的测量。

5、凝胶过滤层析（P132）：

也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

常用的填充材料是葡聚糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（Agarosegel）。

二、问答

1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？

（PPT8）

（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；

（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；

（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；

（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等；

（5）根据配体特异性，如亲和层析。

【P109生物大分子的分离纯化方法和技术有：

（1）沉淀法（包括：

盐析、选择性沉淀、有机溶剂沉淀等）；

（2）层析法（如凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析等）；（3）离心、制备HPLC以及等电聚焦制备电泳等。

】

2、分离纯化过程中，如何保持核酸的完整性？

（P114，PPT17）

在整个操作过程中应尽量简化操作步骤，缩短提取过程，避免各种有害因素对核酸的破坏。

（1）温度不宜过高（0～4℃合适），高温将会破坏氢键；

（2）控制pH值范围（4-10合适），过酸或过碱会破坏磷酸二酯键；

（3）保持一定离子强度;

（4）减少物理因素对核酸的降解。

3、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？

（PPT59）

（1）原因：

①材料不新鲜或反复冻融；

②未很好抑制内源核酸酶的活性；

③提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断；

④外源核酸酶污染；

⑤DNA提取物反复冻融。

（2）解决方法：

①尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；

②液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；

③在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量；

④细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔；

⑤所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌；

⑥将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

【补充：

1、DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

（1）原因：

①DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质；②DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应；③DNA中残留有金属离子。

（2）对策：

①重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质；②重新沉淀DNA，让酒精充分挥发；③增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）。

2、DNA提取量少。

（1）原因：

①实验材料不佳或量少；②破壁或裂解不充分③沉淀不完全；③洗涤时DNA丢失。

（2）对策：

①尽量选用新鲜（幼嫩）的材料；②动植物要匀浆研磨充分，G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁；③高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）；④低温沉淀，延长沉淀时间；⑤加辅助物，促进沉淀；⑥洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。

】

4、在蛋白质分离纯化过程中应注意哪些因素？

（P129，PPT67）

1）缓冲液；2）盐、金属离子和螯合剂；3）还原剂；4）去垢剂；5）增溶剂；6）蛋白酶抑制剂（pronaseinhibitor）；7）蛋白质的环境因素：

①表面效应的影响；②温度的影响；③保存方式的影响。

第8章核酸分子杂交技术及应用

问答

1、有哪些常用的探针标记物？

如何进行探针的标记？

有哪些分类？

P148-P156

（1）探针标记物：

根据标记物的特性可分为放射性同位素标记和非放射性标记两大类。

1）常用标记探针的同位素有：

32P、3H、35S、131I、125I等。

2）常用的非放射标记物有：

辣根过氧化物酶（herseradishperoxidase，HRP），荧光素（fluorescein），生物素（biotin）、光敏生物素（photobiotin）、地高辛（digoxigenin，DIG）、等。

探针标记的方法:

1）放射性同位素标记探针的方法有：

缺口平移法、随机引物法、末端标记法和反转录标记法等。

①缺口平移法，先由具备修复DNA链功能的DNaseⅠ在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸，同时在3′端修复加入被标记核苷酸，从而获得高比活性的DNA探针。

②随机引物法，是一种以单链DNA或RNA为模板的，较理想的高比活性核酸探针标记方法。

③DNA探针的末端标记法，是将探针末端（5′或3′）的核苷酸进行标记。

【T4DNA聚合酶标记法，利用T4DNA聚合酶的5′-3′DNA聚合酶活性，可催化同位素标记的dNTP填补限制性内切酶消化的粘性末端。

其它DNA探针的末端标记如：

末端脱氧核苷酸转移酶标记法，末端脱氧化核苷酸转移酶能催化脱氧核苷酸加到单链或双链DNA的3′末端上；Klenow大片段的末端标记法，Klenow大片段来源于E.coliDNA聚合酶Ⅰ全酶，具有5′-3′聚合酶的活性和极弱的3′-5′核酸外切酶活性，应用此酶的特性可对DNA片段的3′末端进行标记；T4多核苷酸激酶标记法，该法系5