抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测.docx

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抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测

抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测

来源：

检验医学在线2０09-4-１5南网编辑2010-7-６

一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验

（一）纸片琼脂扩散法

　纸片琼脂扩散法又称Ｋirｂｙ-Bauer试验,是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。

　1．试验原理　将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。

纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（ＭIＣ）呈负相关关系,即抑菌圈越大,MIC越小。

　2．培养基和抗菌药物纸片

（1）培养基:

水解酪蛋白（Mueller-Ｈiｎ-ｔoｎ，MH）培养基是CLＳI/NCCＬS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基,ｐH值为7.2～7.4,对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。

琼脂厚度为4mm。

配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中４℃保存,使用前应将平板置35℃孵育箱孵育,使其表面干燥。

　（２）抗菌药物纸片:

选择直径为6.35mm，吸水量为20uｌ的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。

含药纸片密封储存２～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β－内酰胺类药敏纸片应冷冻储存,且不超过l周。

使用前将储存容器移至室温平衡l~２h,避免开启储存容器时产生冷凝水。

　　　3.细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。

用０.５麦氏比浊标准的菌液浓度。

校正浓度后的菌液应在１５mｉn内接种完毕。

接种步骤如下：

①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后,在琼脂表面均匀涂片接种3次,每次旋转60°,最后沿平板内缘涂抹１周；②平板置室温下干燥３~5miｎ，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16~18ｈ后阅读结果,对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育２4h。

4.结果判断和报告　用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域）,当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。

对另外一些菌,在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。

变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。

由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长,生长层小于20％可忽略不计。

根据CＬSＩ/NＣＣLS标准,对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式（敏感/中度敏感/中介、耐药）。

（二）稀释法

如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量（浓度）的抗菌药物呈敏感时,就必须使用稀释法（dilutionmeｔhoｄ）。

稀释法包括两

种:

肉汤稀释法和琼脂稀释法，分别介绍如下:

　1.肉汤稀释法有常量稀释法（mac-roｄｉlｕtion）和微量稀释法（ｍicrodｉlｕtiｏn）,前者含药肉汤含量每管≥l.0ｍl（通常2m１），后者每孔含０.1ml。

商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。

（1）培养基:

使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。

在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。

培养基制备完毕后应校正pH值为7.2~７．4（２5℃）。

离子校正的M－Ｈ肉汤（CAMHB）为目前推荐的药敏试验培养液。

（2）药物稀释①药物原液制备：

抗菌药物直接购自于厂商或相关机构,所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。

质量（mg）=溶剂（ml）×浓度（ｕg/ml）/分析效能（ｕg/mｇ）

容积（ｍ１）＝质量（mg）　×分析效能（ug/ｍg）/浓度（ug/ｍl）

配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pＨ值为６．０，0．1mol/L磷酸盐缓冲液等。

一般原液浓度不低于100０ug/ml或１0倍于最高测试浓度，原液应储存于－６0℃以下,保存期不超过６个月。

②稀释抗菌药物的制备：

行２倍系列稀释，使其终浓度（ｕg/m1）为5１2、2５６、128、６4、３2、16、8、4、２、1、0、0.5、0.2５、0．１25等。

（3）菌种接种：

配制0．5麦氏浓度菌液，用肉汤（常量稀释法）、蒸馏水或生理盐水（微量稀释法）稀释菌液,使最终菌液浓度（每管或每孔）为5×1０5CＦＵ／ｍl,稀释菌液于１５min内接种完毕,3５℃孵育16～20h,当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为２0～２4h,试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满24h以上。

　（4）结果判断：

以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（ug/ｍ１）。

甲氧苄啶（甲氧苄胺嘧啶）或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断，以细菌数为阳性对照的８０%即可作为判断细菌生长指标。

微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。

　2.琼脂稀释法琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板,使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。

（1）培养基:

M-H琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基,调整ｐH值在7.2～7.４（２５℃），过高或过低的pＨ值会影响药物效能。

（2）含药琼脂制备:

将已稀释的抗菌药物按１：

9（配制的药物溶液：

琼脂培养基）加入,加热溶解琼脂,在45~５0℃水浴平衡融化MH琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为3~4mｍ。

室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中，置2~8℃，储存日期为5d,对易降解药物如含头孢克洛,在使用４8h之内制备平板,使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中3０min以使琼脂表面干燥。

　（３）细菌接种：

将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍,以多头接种器吸取（为１～2ul）接种于琼脂表面,稀释的菌液于l5ｍin内接种完毕,接种后置35℃孵育16～20h（MRS、VRE孵育时间需满２4h），奈瑟菌属、链球菌属细菌置于５％C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

　　（４）结果判断:

将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长）。

试验菌的结果报告可用MIC（ug/ｍg）或用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。

　　（三）E试验

　E试验（Epsiｌｏmeｔer　ｔesｔ）是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。

　1．试验原理　E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体,一面固定有一系列预先制备的,浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。

抗生素的梯度可覆盖有２０个ＭIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判断有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。

　将Ｅ试条放在细菌接种过的琼脂平板上,经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（ＩＣ）,它与MＩC呈高度相关。

２.细茵接种和加样使用厚度为4mmM-H琼脂平板,用０.５麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MＩC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。

采用CＬＳl/NCＣLＳ　AST执行标准推荐孵育条件。

3.结果判断和报告读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。

E试验IC值与CLSl/ＮCCLＳ的稀释法ＭIC参考值高度相关,二者直接相对应,CLSｌ／NCＣLSMＩＣ折点值适用于E试验。

但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。

二、苛养菌的药物敏感试验

　肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通ＭH培养基中快速生长,上述的药敏试验条件不适合它们。

它们需要更为复杂的培养基、孵育条件,在进行药敏试验时,质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。

下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。

各自的结果判断标准请参考CＬSl/NＣCLS手册。

（一）嗜血杆菌属

　１．试验条件

（1）培养基：

使用嗜血杆菌属试验培养基（hemｏphilｕstest　mediuｍ，ＨTＭ）。

（2）接种菌液:

菌悬液终浓度为５×105ＣFU／ml。

　（３）孵育条件:

35℃下孵育20～24h观察结果。

对于扩散法,35℃、5％~７％Ｃ02下孵育l６～18ｈ观察结果。

　　２．质量控制　　流感嗜血杆菌AＴCＣ492４7、流感嗜血杆菌ATCC４97６6、大肠埃希菌ATCＣ35218（用于β－内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂）为推荐参考菌株。

　　3.结果判断注意事项

　　（１）血液、脑脊液分离株仅需做氨苄西林、三代头孢菌素中的一种、氯霉素和美罗培南。

（2）耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产ＴＥＭ型β－内酰胺酶。

大多数情况下,直接检测β－内酰胺酶更快。

　（3）β－内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药（β-Ｌaｃtmａｓe-negaｔivｅ，amｐiｃillｉn-resｉstanｔ,BL-NAR）的流感嗜血杆菌株少见。

然而，不论其体外药敏试验是否出现敏感，均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林／舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西林／他唑巴坦耐药。

（二）肺炎链球菌

１．试验条件

（1）培养基：

肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。

（2）接种菌液:

菌悬液终浓度为l05CFＵ/ml。

　　（３）孵育条件:

3５℃下孵育20~24h。

　2.质量控制　肺炎链球菌ATＣC４９619、大肠埃希菌ATCC３52１8（用于β－内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂）为推荐参考菌株。

　３．结果判断注意事项

（1）对青霉素敏感者，均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感；青霉素中介或耐药株,不推荐做上述药物的药敏试验,因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。

应当及时通知临床医生，然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南的ＭIC。

（2）静脉注射高浓度青霉素（肾功能正常的成人2×106U/4h）或氨苄西林（29/6h）对青霉素中介的肺炎链球菌是有效的。

标准剂量的头孢曲松、头孢噻肟对中介的肺炎链球菌也有临床疗效,但在发现该菌株引起的脑膜炎时常用最大剂量治疗。

　　（三）肺炎链球菌外链球菌属

　1.试验条件

　（１）培养基：

肉汤稀释法同肺炎链球菌,琼脂稀释法用含5%羊血琼脂。

（2）接种菌液：

菌悬液终浓度为5×105CFU/ml。

（3）孵育条件:

35℃下孵育20~２4h。

琼脂稀释法需５％C0。

。

　2.质量控制　肺炎链球菌ATCC４961９为推荐质控菌株。

３.结果判断注意事项

（1）化脓性链球菌一般不需做青霉素药敏试验，该菌目前对青霉素仍为敏感株,只有某些无乳链球菌可能会对青霉素产生中介结果。

　　（２）对青霉素敏感的链球菌,同时被认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林／舒巴坦、头孢克洛、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟等敏感，毋需对这些抗生素进行药敏试验。

（3）青霉素或氨苄西林中介的菌株，需用氨基糖苷类联合用药进行治疗。

（４）对红霉素耐药者或敏感者常提示对阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素耐药或敏感。

三、分枝杆菌的药物敏感试验

（一）结核及慢生长分枝杆菌的药物敏感试验

　由于结核及慢生长分枝杆菌生长缓慢，在生长前,药物已扩散至培养基中,不能有效影响其生长。

故不适用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验。

结核及慢生长分枝杆菌药敏试验的药敏培养基、含药浓度、接种菌量、结果解释等都有其特殊性。

比例法是WH0/ＩＵＡTＬD全球结核病耐药监测方案中推荐的方法,目前国外普遍采用此法。

国内多采用绝对浓度法，据报道，该法比比例法的耐药菌检出率要低5%~10%。

某些微生物自动鉴定和药敏系统则采用放射核素等方法。

　１.绝对浓度法（ａbsｏｌuｔｅｃoncenｔｒatioｎｍetｈod）该法以“无生长”为终点或为最低抑菌浓度（MIＣ）来判断耐药与否,每种药物需制备两种不同浓度的含药培养基，同时用不含药培养基作为对照,接种菌液最终浓度为1ug／ml,３7℃培养4周观察结果。

判断标准为对照培养基上细菌生长良好，含药培养基上菌落>20个判为耐药。

（1）试验条件①培养基：

改良罗氏培养基（Loｗenｓｔein-Jｅnｓeｎ,L-J）。

②试验药物：

试验用药物和药物浓度（表6-2）。

③接种菌液：

多点刮取培养物少许，置于磨菌器中，用磨菌捧捻磨,使呈乳酪样，以0.5％Twｅｅn－80生理盐水稀释，与比浊管比浊,配制成ｌｍg/mｌ菌悬液,然后以灭菌生理盐水稀释至l０-２mｇ/ml。

试验时每点接种lOOｕl。

④孵育条件:

３7℃下孵育4周。

（2）质量控制:

①结核分枝杆菌H37RｖATCＣ2７294为一线、二线药的敏感质控菌株；②结核分枝杆菌H３7Rv　ATCC3５8２0为链霉素耐药质控菌株;③结核分枝杆菌H37ＲvＡＴCC35822为异烟肼耐药质控菌株;④结核分枝杆菌K３７RvＡTＣＣ3582６为环丝氨酸耐药质控菌株；⑤结核分枝杆菌H３７Rv　AＴCC35827为卡那霉素耐药质控菌株;⑥结核分枝杆菌Ｈ３7RvATCC35828为吡嗪酰胺耐药质控菌株；⑦结核分枝杆菌H3７ＲvATＣC３5８30为乙硫异烟胺耐药质控菌株；⑧结核分枝杆菌H37RｖAＴCC35８37为乙胺丁醇耐药质控菌株；⑨结核分枝杆菌H37RvATCC35８38为利福平耐药质控菌株。

　　（３）结果判断注意事项:

每周阅读平板1次。

根据CＬSＩ／ＮCＣLS药敏测定时间，结核分枝杆菌为３周,慢生长分枝杆菌为2周，到4周末终止培养。

结果报告方式分敏感、低浓度耐药、高浓度耐药和实报菌落数4种。

判断标准如下:

①敏感。

含药培养基上无菌落生长。

②低浓度耐药。

低浓度含药培养基上菌落数>２0个,高浓度含药培养基上无或极少菌。

③高浓度耐药。

低浓度含药培养基上菌落茂盛,高浓度含药培养基上菌落数>20个（＋菌落数约占斜面面积ｌ/4；++菌落数约占斜面面积ｌ/2；+++菌落数约占斜面面积3/4;++＋＋菌落呈菌苔样生长）。

④实报菌落数。

低浓度含药培养基上菌落数<２0个时，实报菌落个数。

　2．比例法（pｒoportｉoｎaｌmetｈod）此法是在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液，以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。

（1）试验条件:

①培养基Milddleｂrooｋ7Ｈ1０琼脂。

②试验药物。

在表６-２中列出了ＣLＳI/NＣCLＳ推荐的抗结核分枝杆菌比例法药敏试验用药物和药物浓度。

③接种菌液。

调整细菌浓度为1麦氏浓度,再将其用7Ｈ９肉汤稀释成１0２和１04倍两种浓度。

分别吸取两种不同浓度的菌液l０ｕl（标准接种环一接种环）接种于同一个浓度的含药培养基及对照培养基。

④孵育条件。

3７℃下孵育4周。

（2）质量控制：

基本同绝对浓度法。

（3）结果判断注意事项:

在两个浓度梯度的平板中,计数易数出菌落数的那一个，与对照平板菌落数相比，算出耐药百分比。

　３．放射核素法BACTEＣ—ＴＢ　４60等仪器检测系统使用放射核素法进行快速检测。

具体使用见产品说明书。

（二）快速生长分枝杆菌的药物敏感试验

快速生长分枝杆菌在合适的固体培养基上孵育5～7d肉眼可见细菌菌落生长。

其药物敏感试验常以肉汤稀释法进行，操作方法基本同需氧和兼性厌氧菌。

菌种用胰大豆肉汤或CAMHB加上０.02%Ｔｗeen－８0，以避免细菌的聚集。

３0℃孵育3~５d后观察结果。

四、厌氧菌的药物敏感试验

由于厌氧菌对目前常用抗生素的敏感性较为稳定,加之厌氧菌培养要求特殊,临床实验室一般不做体外药敏试验。

发生下述临床情况时应考虑体外药敏试验：

①明确厌氧菌引起的严重感染；②已确诊的厌氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏效;③需长期用药的厌氧菌感染。

厌氧菌体外药敏试验基本原理和方法与需氧菌相同，只是培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。

　　1.培养基采用布氏血琼脂（Ｂrucelｌablｏoｄagar）。

配制完毕的布氏血琼脂储存期不能超过７d（4~l0℃），最好不能长于72h。

含亚胺培南和克拉维酸的培养基必须使用当天制作平板。

布氏心脑浸液加入３%~5％冻融羊血为稀释法培养基。

2．孵育条件　　厌氧箱和厌氧罐是必需配置的，气体条件为８0%N２、l0%H2和l0%C02，还需加入冷催化剂钯粒和亚甲蓝指示剂,3５～37℃孵育48h。

3.质控菌株脆弱类杆菌ＡTCC2528５、多型类杆菌ATCＣ２9７41、迟缓优杆菌ATCC

430５5。

五、抗菌药物敏感试验的质量控制

抗菌药物药敏试验必须做有效的质量控制,以保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性。

要完成有效的药物敏感性试验,除了必须采用可靠的试剂和检测系统外,实验室应建立一套完善的操作流程和评价程序,以规范试验中使用的各种试剂，规范操作者的操作和对结果的判断。

（一）质量控制参考菌株的质控试验

　除了阳性生长对照试验、纯度对照试验、接种量对照试验、结果终点判读对照试验等外,临床微生物室常通过对已知的抗生素敏感的菌株进行测试，以达到综合质量控制目的。

　　CＬSI/NＣＣＬS2００４AST执行标准推荐下述参考菌株为稀释法ＭIC的测定:

金黄色葡萄球菌ＡＴCC２9２１3,金黄色葡萄球菌ＡＴCC　43３0０,肺炎链球菌ATＣＣ　4９６1９，粪肠球菌ATCC２9２１２,粪肠球菌ATCＣ51２99，淋病奈瑟菌ＡＴＣC49２26,大肠埃希菌ATCC2８922，大肠埃希菌ATＣC352１8，肺炎克雷伯菌ATCC70０60３,铜绿假单胞菌ＡＴCＣ２7８５3，流感嗜血杆菌AＴＣC　４9247,流感嗜血杆菌ＡTＣＣ49766。

　　一般来说,这些菌株同样也适用于琼脂扩散法。

金黄色葡萄球菌AＴCC25923只用于琼脂扩散试验。

大肠埃希菌ＡTＣＣ352１8仅推荐用于含β－内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦的抗生素）药敏试验;金黄色葡萄球菌ATCC43３00和29213使用于苯唑西林盐琼脂筛选试验;粪肠球菌ATCC５1２99和2９２12使用于万古霉素筛选试验和高水平耐氨基糖苷类肠球菌药敏试验;肺炎克雷伯菌700６0３使用产ＥSBLS的试验。

质控菌株需用临床分离株相同的培养基和方法进行标准法的药敏试验。

CLSI/ＮCＣLＳ质控菌株的ＭＩC预期值和抑菌圈直径参见CLSI/ＮCCＬS手册。

质控菌株稀释法药敏试验的ＭIＣ应位于整个试验浓度范围的中部。

储存质控菌种应在菌种保存液（5０％胎牛血清肉汤或１0％～l5%胰大豆肉汤）中置于-20℃或-80℃或液氮中，也可冷冻真空保存。

冻存的或冷冻真空的培养物至少在试验前需传代２次。

工作中的质控菌株在胰大豆琼脂（一般菌）或巧克力琼脂（苛养菌）斜面上每周传代一次。

在试验前传代的菌株应在琼脂平板上分离取得单个菌落。

　　质控试验应每日进行。

MIC在预定值范围外时，需查找误差原因并予以纠正。

产生误差的原因包括：

①质控菌株选用不当;②细菌菌液浓度不对；③培养基储藏不当或过期失效；④质控菌株或培养基被污染；⑤培养基平板的制作不符合要求;⑥孵育的温度和气体条件不符。

（二）药敏试验平板、肉汤的质量控制

　　常量稀释法的含药肉汤试管、微量稀释法的条板和稀释琼脂平板在使用前均应进行合适质控菌株的测试,观察其MIC是否在预期值范围,不在预期值范围内者应丢弃。

当然，上述培养基应做无菌试验，至少每批抽样一支,孵育过夜，观察细菌有无生长,以确保培养基无菌。

　MH琼脂可用铜绿假单胞菌ATＣC2２7853作为质控菌株，用１0ｕg含药的庆大霉素纸片做药敏试验,其抑菌环直接应在CLＳI/ＮCCＬSAST执行标准预定值范围内。

六、耐药性监测的分子遗传学

　随着分子细菌遗传学和分子生物学技术的不断进步,微生物对抗生素耐药性的遗传学机制不断明了，许多用于检测抗生素耐药性的基因检测方法，如ＰCR、PCR－RFＬP分析、ＰCR－SＳＣP分析、PCR-ＳSP、基因芯片分析、DNA序列测定等，得以发展并在临床实验室应用。

与常规方法相比，基因检测方法检测抗生素耐药基因有下述优点：

有些细菌不能或不易培养，只能检测其基因型；能快速鉴定慢生长细菌的耐药性，能早期指导临床医生治疗用药;有助于判定MIC位于折点或折点附近的细菌药敏试验结果;在细菌耐药性的流行病学追踪调研中,基因检测比抗生素药敏方法准确。

　　　当然，目前抗生素耐药性的基因检测方法尚处于发展早期。

既没有完全弄清细菌耐药的遗传学机制，也没有建立起检验标准。

基因检测药敏试验的主要不足在于：

细菌对同一抗生素的耐药通常可由多种耐药机制引起,基因检测方法通常只能检测某一特定的耐药，而抗生素药敏试验则能用一种培养分析检测不同形式的耐药。

1.β－内酰胺药物耐药基因的检测

（1）耐苯唑西林金黄色葡萄球菌基因的检测:

苯唑西林ＭＩC值为2～8ug/mｌ被判为MＲsＡ（耐苯唑西林金黄色葡萄球菌）的金黄色葡萄球菌可能具有ｍecA基因，也可能是因为产高水平β－内酰胺酶，以至缓慢水解苯唑西林。

临床治疗ＭRSA引起的感染首选万古霉素,而治疗产高水平β-内酰胺酶菌株所致感染，则应使用对酶稳定的β－内酰胺类药物或β-内酰胺/β－内酰胺酶抑制剂合剂。

（２）肺炎链球菌β-内酰胺耐药基因的检测:

肺炎链球菌可获取其他肺炎链球菌或其他链球菌染色体DNA而修饰自身ＰBP（青霉素结合蛋白）导致耐药。

PＢP2ｂ基因序列（该序列仅出现于青霉素敏感菌株）的PCR阴性则提示可能介导耐药。

　（３）革兰阴性菌β-内酰胺基因的检测：

编码革兰阴性菌中的TEM、SHV、OXA等β-内酰胺酶的基因的DNＡ探针和PＣR引物已能合成,可用于基因检测方法检测。

还可采用等电聚焦电泳和DNA测序作为鉴定新的β-内酰胺酶基因的筛选工具。

　2．氨基糖苷类耐药基因的检测革兰阴性细菌具有多种不同类型的耐氨基糖苷类耐药基因，如转乙酰基酶、转腺苷酶和转磷酸基酶编码基因。

目前为止，尚无一种ＤNA探针或ＰCＲ引物预测它们的耐药性。

　革兰阳性细菌对氨基糖苷类的耐药性较单一,通对DNＡ和PＣR方法可检测出氨基糖苷类高水平耐药基因,如检测肠球菌ant（6）链霉素耐药基因和编码庆大霉素耐药的aac（6’）-aｐh（2’）基因。

3.大环内脂、林可霉素、米卡霉素（密柑霉素）耐药基因的检测　ｍｅfＡ和meｆＥ为大内脂类抗生素泵出基因。

肺炎链球菌耐红霉素，常由mefＥ基因介导。

红霉素甲基酶基因（erm）介导大环内酯类、林可霉素和米卡霉素耐药。

msrA基因仅介导对大环内脂类和米卡霉素耐药。

ｍsrA的PCＲ分析法可判定是存在mｓｒＡ还是crmＡ，以辅助是否可选用氯洁霉素治疗耐红霉素葡萄球菌感染。

　　4.喹诺酮耐药基因的检测喹诺酮耐药的两大主要机制为:

①靶位改变。

DNA解旋螺旋酶（由gyｒA和ｇｙrB编码）和拓扑异构酶（由parＣ和pａrE编码）改变；②药物主动泵出。

耐药常与9ｙｒ和par位点突变相关。

PCＲ技术扩增后测定ｇyrA、parC和pａrE基因的核酸序列有助于检测对喹诺酮的耐药性。

5．糖肽类耐药基因的检测　肠球菌耐药性有几种不同的基因,包括v