芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究本科毕业论文.docx
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芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究本科毕业论文
本科生毕业论文
题目芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究
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芦丁与牛血清白蛋白的相互作用研究
摘要：
在Tris缓冲溶液（pH=7.4）体系中，用荧光光谱技术研究水溶液中芦丁与牛血清白蛋白的相互作用。
结果表明，芦丁对牛血清白蛋白内源荧光（345nm）产生较强的荧光猝灭作用，根据不同温度下芦丁对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用,证明其为静态猝灭机制,计算出290K、298K时结合常数Ka（分别为4.384×103L·mol-1、0.7032×103L·mol-1），根据热力学参数确定其作用力以范德华力或氢键作用力为主。
关键词：
芦丁；牛血清白蛋白；荧光光谱
StudyonthebindinginteractionbetweenrutinandBSA
UndergraduateLuoTao
SupervisorXingMing
Abstract：
Theinteractionofrutinandbovineserumalbumin（BSA）inaqueoussolution（Tris-HClbuffer,pH=7.4）hasbeenstudiedbyfluorescencespectrometry.TheresultsshowedthatthefluorescenceintensityofBSAat345nmwasquenchedintensivelybyrutin.AccordingtothequenchingeffectofrutinonthefluorescenceintensityofBSAunderdifferenttemperatures,andthequenchingmechanismwasconfirmedtobeastaticone.ThebindingconstantsKaat290Kand298Kwere4.384×103L·mol-1and0.7032×103L·mol-1.Basedonthethermodynamicparameters,theelectrostaticactionwasconfirmedtobeVanderwallsforceorbond.
Keywords：
Rutin;Bovineserumalbumin;Fluorescencespectroscopy
目录
前言1
1芦丁、牛血清白蛋白、荧光分析的介绍1
1.1芦丁的简介1
1.2芦丁的药理作用1
1.2.1抗自由基活性1
1.2.2抗脂质过氧化作用2
1.2.3血管舒张作用2
1.2.4抗病毒作用2
1.2.5拮抗血小板活化因子作用3
1.2.6抗急性胰腺炎（AP）3
1.2.7对胃溃疡的保护作用4
1.3牛血清白蛋白简介4
1.4荧光分析的特点和应用4
2实验部分5
2.1仪器5
2.2试剂5
2.3标准溶液配制6
2.3.11mol·L-1NaCl水溶液6
2.3.21.0×10-4mol·L-1的牛血清白蛋白溶液6
2.3.3运行的Tris-HCl缓冲溶液配制6
2.3.4牛血清白蛋白溶液体系的配制6
2.4荧光测量6
2.4.1室温（290K）下的测量6
2.4.2298K下的测量7
3数据处理与结果讨论7
3.1.1基础理论8
3.1.2温度的影响8
3.1.3药物分子与蛋白质分子间结合力的确定12
结论13
参考文献13
致谢16
前言
1芦丁、牛血清白蛋白、荧光分析的介绍
1.1芦丁的简介
芦丁（见下图1-1）又名芸香苷、紫槲皮苷，为一来源很广的黄酮类化合物。
主要存在于豆科植物槐的花蕾（槐米）、果实（槐角），芸香科植物芸香全草，金丝桃科植物红旱莲全草及蓼科植物荞麦的籽苗中[1]。
图1-1芦丁的结构式图
1.2芦丁的药理作用
1.2.1抗自由基活性
芦丁为黄酮类化合物，是清除自由基的强氧化剂，它可终止自由基的连锁反应，抑制生物膜上多种不饱合脂肪酸的过氧化作用，清除脂质过氧化产物，起到保护生物膜的药理作用[2]。
姜宝红等[3]考察了体外具有较强醛糖还原酶活性的芦丁对大鼠糖尿病肾病（ND）的防治作用，结论提示芦丁可改善四氧嘧啶大鼠糖尿病肾病，其机制可能与抑制醛糖还原酶和消除氧自由基有关。
芦丁在体外具有自由基清除（在10-2mol·L-1时的抑制率达到31.4%）和抑制醛糖还原酶活性（在10-2mol·L-1时的抑制率达到74.2%）的作用，从而阻止葡萄糖转变为山梨醇，减弱山梨醇通路激活对大鼠造成的损害。
另外，芦丁可降低肾组织脂质过氧化物酶（LPO）活性，延缓氧自由基对肌体的进一步损伤。
陈仙等[4]探讨了芦丁是否对高能冲击波引起的肾功能损伤有保护作用。
有学者认为体外冲击波碎石术除产生机械作用外。
还可能对肾组织细胞产生生物化学作用，这种作用的基础是氧自由基。
氧自由基的产生参与了体外冲击波碎石术后肾功能损害。
有资料证实，芦丁具有阻止氧自由基所致的脂质过氧化作用及稳定细胞膜、抑制细胞膜系统内钙离子水平的异常升高，并通过舒张血管平滑肌而改善肾脏有效血浆流量（ERPF），增加肾小球滤过率。
实验证实在体外冲击波碎石术前应用芸香苷，则体外冲击波碎石术后血丙二醛（MDA）含量较对照组患者明显降低，血超氧化物歧化酶（SOD）活性较对照组明显升高，提示芦丁可使氧自由基减少，SOD活性上升。
因此，芦丁通过上述药理作用发挥效应，减轻高能冲击波对肾组织细胞的损害，有效地防治体外冲击波碎石术所致的肾脏损伤。
研究表明，脑在缺血低氧时有大量的一氧化氮（NO）及自由基产生，这可能与脑细胞的凋亡有关，如对脑缺血损伤有一定的保护作用，其保护作用可能与其抗自由基作用、抗凋亡及减少NO生成有关。
1.2.2抗脂质过氧化作用
脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而引起的一系列氧化过程。
朱建林等[5]通过对大鼠SOD活性、自由基脂质过氧化产物MDA含量及大肝脏脂褐（Lipofuscin）含量的测定及分析发现，芦丁对去势大鼠脂质过氧化有抑制作用，可抑制去势后大鼠抗氧化系统抗氧化能力的下降。
芦丁具有对抗内源性雌激素下降引起的抗氧化能力的下降，具有抗氧化作用。
高密度脂蛋白（HDL）具有抗动脉粥样硬化作用。
但HDL与低密度脂蛋白（LDL）及极低密度脂蛋白（VLDL）一样在体外也可被氧化修饰，一旦HDL被氧化修饰则具有致动脉粥样硬化作用。
孟芳等[6]利用体外Cu2+介导氧化修饰的手段，探讨了芦丁对HDL氧化修饰作用的影响。
结论表明芦丁可显著抑制HDL的氧化修饰。
1.2.3血管舒张作用
实验检测芦丁对去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）预收缩的胸主动脉环张力的影响，表明芦丁可能通过NO鸟苷酸环化酶途径产生内皮依赖性的血管舒张作用[7]。
1.2.4抗病毒作用
有研究表明，芦丁有抗病毒和抑制醛糖还原酶活性的作用。
实验发现，芦丁的肺指数抑制率27.3%，能够降低流感小鼠的肺指数，具有明显的抗流感病毒的作用，并与有关芦丁能够使毛细血管的脆性及异常的通透性得到改善的报道相一致[8-9]。
1.2.5拮抗血小板活化因子作用
血栓形成、动脉粥样硬化、炎症反应及缺血再灌注自由基损伤等诸多心脑血管疾病的发病过程均与血小板活化因子（PAF）介导密切相关，因此拮抗PAF的作用，为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径。
实验表明，芦丁可拮抗PAF与兔血小板膜受体的特异性结合，抑制PAF介导兔血小板黏附与PMNS内游离Ca2+浓度升高，表明芦丁抗PAF的作用机制是通过抑制PAF受体活化，进而阻断PAF诱发的反应，从而起到保护心血管的作用，结果表明芦丁为一种PAF受体拮抗药[10]。
1.2.6抗急性胰腺炎（AP）
芦丁能有效防止低钙血症的发生，并降低胰腺组织Ca2+浓度。
研究发现芦丁能提高胰腺组织大鼠磷脂酶A2（PLA2）含量，提示芦丁可能对胰腺组织PLA2的释放及激活具有抑制作用；芦丁能有效防止AP大鼠低钙血症的发生，可能是通过阻止Ca2+内流并降低胰腺组织细胞Ca2+超载，而减轻对AP的病理生理损害[11]。
赵维中等采用放射免疫分析法测定经注射芦丁的模型大鼠血浆血栓素B2（TXB2）、前列腺环素（PG12）及内皮素含量变化。
结果芦丁皮下注射给药能有效降低AP大鼠血清淀粉酶含量，改善胰腺组织的病理学变化。
与SO组比较，AP模型组造模后12h血浆的T/P比值较SO组均显著性升高（P<0.01）；芦丁各用药组的T/P比值较AP模型组显著性降低（P<0.01）。
芦丁抗实验性AP作用机制可能与降低血浆T/P比值，改善胰腺微循环障碍有关。
陈爱华等[12]观察各组Wistar大鼠血液流变学、酶学及胰腺的病理学改变，并对胰腺病理切片进行评分比较。
结果AP大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞比容、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数均显著升高，病理检查显示胰腺组织明显坏死和炎性细胞浸润。
芦丁（120，60，30mg·kg-1）皮下注射给药，可改善上述各项病理生理指标，结果显示芦丁能有效改善AP大鼠血液流变异常，保护胰腺组织。
芦丁在产生抗AP作用同时，能够降低AP大鼠血清异常增高的NO水平，提示芦丁的抗AP作用机制与其降低NO水平有关。
研究表明，组织中氧自由基的防御、损害系统的平衡失调乃是其致AP组织损伤的原因。
研究显示，芦丁可显著减少AP大鼠胰腺组织的MDA含量，再次证明了芦丁可以抑制氧自由基对膜的过氧化作用。
同时发现芦丁可提高胰腺组织SOD清除氧自由基的活力。
提示芦丁一方面通过增强机体对氧自由基的清除能力，另一方面也可通过抑制AP过程中氧自由基对
膜脂质的过氧化作用，发挥抗AP作用[13]。
1.2.7对胃溃疡的保护作用
有报道芦丁对大鼠应激性胃黏膜损伤具有预防性保护作用。
王宇翎等在实验中利用大鼠醋酸烧灼型胃溃疡模型，测量大鼠胃溃疡体积及组织病理学检查，并观察芦丁和银杏叶提取液（GBE）对胃液量、胃酸、胃蛋白酶活性的影响。
芦丁（5，10mg·kg-1）和GBE（25，50mg·kg-1）造模后给药，可明显减小溃疡体积，组织病理学变化较轻，且对大鼠胃液量，胃液酸度和胃蛋白酶活性无明显影响，显示芦丁对大鼠胃溃疡有明显的治疗作用。
1.3牛血清白蛋白简介
牛血清白蛋白是血液的主要成分，称作BSA，分子量为68kD，等电点4.8，含氮量16%，含糖量0.08%，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。
白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。
每一个蛋白分子能携带七个脂肪酸分子。
这些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子。
血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子。
白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。
尤其是血清蛋白，能够携带着许多药物分子[14]，比如芦丁，正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且比较容易地被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一。
血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用[15-17]。
1.4荧光分析的特点和应用
荧光分析是由试样溶液所产生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的含量。
荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且还与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关。
对于光敏物质所允许的照射强度虽有所限制，但光度计的灵敏度却可以大大增加。
因此，荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。
比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的[18]。
荧光分析法的另外一个优点是选择性高。
这主要是指对有机化合物的分析而言，因为凡是会发生荧光的物质，首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不一定会发生荧光，而且对于某一些给定波长的激发光，会产生荧光的一些物质所发出的荧光波长也不尽相同，因而只要控制荧光分光光度计中激发发光和荧光单色器的波长，便可能得到选择性良好的方法。
荧光光谱技术[19-20]已成为研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段，荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色集团的结构及其所处的微环境提供有用信息。
其中中药有效成分与蛋白质相互作用的研究陆续有报道，大多是从电化学、荧光、紫外方面进行的研究。
本文用荧光光谱法研究在模拟机体生理pH值条件下芦丁与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用；讨论芦丁与BSA之间发生的有效的猝灭过程，讨论其在不同温度下的结合常数、热力学因素等重要信息，确定其分子间的结合力，试图从分子水平了解蛋白质分子与小分子间相互作用机制，了解其在体内的运输和分布情况，为生命科学研究提供有用的信息和数据。
2实验部分
2.1仪器
RF-4500PC荧光光谱仪（Hitachi，Japan）
微量可调移液器（Gilson，French）
PHS-2C型数字式pH计（Ridao instruments）
SYC-15超级恒温水浴（南京桑立电子设备厂）
SWQ-Ic数字控温仪
AUW220D十万分之一天平（SHIMADZU，Japan）
1.0cm比色皿
25mL比色管
50mL 容量瓶
2.2试剂
牛血清白蛋白（BSA，上海伯奥生物科技有限公司），贮备液于277K冰箱中保存
芦丁（sigma公司）溶液浓度为8.035×10-4mol·L-1
Tris-试剂（三羟甲基氨基甲烷，成都科龙化工试剂厂）
盐酸（A.R.，成都科龙化工试剂厂）
乙醇（A.R.，成都科龙化工试剂厂）
NaCl（A.R.，成都科龙化工试剂厂）
所用试剂均为分析纯
实验用水为蒸馏水
2.3标准溶液配制
2.3.11mol·L-1NaCl水溶液
称量2.9285gNaCl固体，用蒸馏水稀释至50mL，摇匀；作用：
以维持生理条件下的离子强度。
2.3.21.0×10-4mol·L-1的牛血清白蛋白溶液
称量0.33521g牛血清白蛋白固体，用蒸馏水溶解稀释至50mL；
2.3.3运行的Tris-HCl缓冲溶液配制
移取Tris溶液（0.2mol·L-1）25.00mL和盐酸溶液（0.1mol·L-1）40.00mL，蒸馏水7.54mL，混合均匀，调节pH=7.4。
2.3.4牛血清白蛋白溶液体系的配制
在10mL比色管中依次加入1.0×10-4mol·L-1BSA溶液0.1mL；1mol·L-1NaCl水溶液1mL，使缓冲溶液的离子强度保持一致；pH=7.4的Tris-HCl缓冲液稀释至10mL。
2.4荧光测量
2.4.1室温（290K）下的测量
RF-4500PC荧光光谱仪操作如下：
（1）开机准备
打开样品室盖，检查样品室内没有样品后关上样品室盖。
（2）开机
打开电源开关（POWER-ON）待风扇正常运转后按（X.LAMRSTART）钮，黄色指示灯亮。
在氙灯点亮后，等待5-10min，打开（MAIN-ON）。
打开计算机及外设，点击桌面上的Flsoluflonc软件，等待光谱仪的自检。
（3）编辑分析方法。
点击右边菜单的Methed按钮等到出现一个Analysmethed对话框再点击Genera按钮。
在Measurement中选择波长扫描Wavelengthscan。
点击Instrument选择荧光激发Excitation为282.0nm，选择荧光发射光为荧光，扫描波长范围为294.0nm至460.0nm，扫描速度为1200nm·min-1，扫描电压为700V，狭缝宽度为5.0nm。
一切准备就绪后点击OK，方法生成。
（4）测试样品
（a）用移液管移取3mL牛血清白蛋白溶液，放入比色皿中，再将比色皿放入样品室，关上样品室盖，点击Measure按钮，开始测量。
检测完成后点击Report按钮，保存文件，设置文件名0，保存。
（b）打开样品室盖，用微量可调移液器移取20μL芦丁溶液于比色皿中，关上样品室盖，打开搅拌器搅拌3分钟后关掉搅拌器，点击Measure按钮，开始测量。
检测完成后点击Report按钮，保存文件，设置文件名1，保存。
（c）重复
（2）的操作，分别设置文件名为2、3、4、5、6、7、8、9，保存。
（d）测试完后，将数据导出，保存在盘中。
（5）关机
（a）将样品拿出样品池。
（b）退出所有窗口，关掉电脑。
（c）关闭（MAIN→OFF）。
（d）关闭电源。
（e）在记录本上记录使用情况。
2.4.2298K下的测量
操作步骤和290K基本一致，只是在样品测试过程中，需要连接恒温槽，搅拌时间延长到5分钟，其余操作同2.4.1。
3数据处理与结果讨论
3.1猝灭机理及猝灭常数的确定
3.1.1基础理论
动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其作用过程遵循斯特恩-沃尔默（Stern-Volmer）方程：
F0/F=1+Kaτ0[Q]=1+KSV[Q]（3-1）
式中F0和F分别是不存在和存在猝灭体时荧光体的荧光强度；Ka是生物大分子的猝灭常数；τ0是不存在猝灭体时荧光体的荧光寿命；[Q]是猝灭体的浓度；KSV称为Stern-Volmer猝灭常数。
静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从而导致荧光物质荧光强度降低的过程，此过程可用下式描述：
F0/F=1+Ka[Q]（3-2）
式中Ka是静态猝灭常数（即配合物的缔合常数）。
比较式（3-1）和式（3-2）可以看到，无论是静态猝灭还是动态猝灭，F0/F与[Q]之间均存在线性关系，因此仅仅通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据无法判断猝灭现象究竟是属于动态还是静态的。
分静态猝灭还是动态猝灭可以通过以下几个方面来确定：
（1）动态猝灭依赖于扩散，而升高温度导致扩散加快，因此动态猝灭常数将随着温度的升高而增大；但升高温度将导致配合物的稳定性降低，因此静态猝灭常数将随温度的升高而减小。
（2）仔细考察荧光体的吸收光谱。
由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光谱；而静态猝灭中，基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。
（3）静态猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命，τ0/τ=1；而动态猝灭剂的存在使荧光寿命缩短，寿命的减小和荧光强度的减小相等，τ0/τ=F0/F。
3.1.2温度的影响
分别测定了在pH=7.4时290K与298K条件下芦丁对BSA的荧光猝灭情况。
（见图3-1和图3-2及表3-1和表3-2）。
图3-1290K芦丁对BSA荧光光谱图
表3-1290K时，不同浓度芦丁对BSA荧光猝灭光谱数据
序号
C（芦丁）/mol·L-1
F
F0-F
（F0-F）/F
1
0
1502
0
0
2
0.05356×10-3
1417
85.00
0.06000
3
0.1061×10-3
1176
326.0
0.2772
4
0.1607×10-3
1165
337.0
0.2893
5
0.2142×10-3
930.3
571.7
0.6147
6
0.2678×10-3
782.6
719.4
0.9192
7
0.3214×10-3
296.5
1205
4.071
图3-2298K芦丁对BSA荧光光谱图
表3-2298K时，不同浓度芦丁对BSA荧光猝灭光谱数据
序号
C（芦丁）/mol·L-1
F
F0-F
（F0-F）/F
1
0
1700
0
0
2
0.05356×10-3
1232
468.0
0.3798
3
0.1061×10-3
1199
501.0
0.4178
4
0.1607×10-3
1176
524.0
0.4456
5
0.2142×10-3
1146
554.0
0.4834
6
0.2678×10-3
1126
574.0
0.5098
7
0.3214×10-3
1102
598.0
0.5427
由图可知,随着芦丁浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，表明二者之间存在相互作用，产生了猝灭现象。
芦丁对BSA的荧光猝灭的Stern-Volmer图根据Stern-Volmer方程绘制。
不同温度下的[（F0-F）/F]~[Q]曲线见图3-3。
290K
298K
图3-3[（F0-F）/F]~[Q]曲线
由图3-3可以得出Stern-Volmer方程及Stern-Volmer猝灭常数Ka，（见表3-3）。
表3-3Stern-Volmer方程及Stern-Volmer猝灭常数Ka
温度/K
Stern-Volmer方程
Stern-Volmer猝灭常数Ka
相关系数r
290
y=4.384x-0.378
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