微生物学实验讲义.docx

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微生物学实验讲义

实验四显微测微技术及细菌运动性观察

一、目的要求

1．了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。

2．学习悬滴法观察细菌运动性技术

二、实验原理

（一）显微测微技术

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。

其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。

物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0.01mm，即10pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。

目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75mm的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度（有50格和100格两种）测量时，需将其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。

（二）细菌运动性

在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。

通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。

观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。

三、实验器材

1．活材料：

培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母

2．试剂：

香柏油、二甲苯、凡士林等。

3．器材：

目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。

四、操作步骤

（—）显微测微技术

1．装目镜测微尺：

取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒内。

2．校正目镜测微尺

（1）将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上

（2）先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。

利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度＝（两测微尺重合线间镜台测微尺格数

10）/两测微尺重合线间目镜测微尺格数

用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。

（3）酵母细胞大小的测定

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。

（5-10个取平均）

（二）悬滴法观察细菌运动性

1．在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。

2．在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1-2环菌液置于中央。

3．将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。

4．小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心。

5．先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。

观察时光线要调得暗一些。

用悬滴法分别观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的运动性。

细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。

五、注意事项

1．检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动

2．制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。

六、实验结果

1．报告测微计算过程与结果。

2．描述各菌运动方式。

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七、思考题

1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小，测定结果是否相同？

为什么？

实验五酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术

一、目的要求

1．学会使用显微镜观察酵母菌形态的方法。

2．观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。

3．学会区别死活菌的方法。

4．了解血球计数板计数的原理，学会测定酵母细胞总数方法。

二、实验原理

用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16×25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25×16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

计数时，如果使用16×25的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数（即计数100个小格中的酵母细胞数），如果使用25×16规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的酵母细胞数，分别按下述公式计算出酵母细胞数。

（1）16×25格的血球计数板计算公式：

1mL酵母细胞数=A/4×16×104×稀释倍数

（2）25×16格的血球计数板计算公式：

1mL酵母细胞数=A/5×25×104×稀释倍数

三、实验器材

啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝染液。

四、操作步骤

（一）血球板计数

1．菌悬液的制备：

为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5～10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。

2．加菌悬液样品：

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。

3．显微镜计数：

加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数，计数时，对位于线上酵母菌，可采取只记数两条边的办法，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。

4．计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。

（二）死活菌鉴别

1．在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。

2．取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。

3．将载片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

4．染色约0.5h后再进行观察，注意死细胞数量是否增加。

五、实验结果

1．结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。

2．报告计数结果。

六、思考题

根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？

应如何尽量减少误差？

力求准确？

实验六放线菌个体、群体形态观察

一、目的要求

1．学习并掌握放线菌形态的显微镜观察方法。

2．观察放线菌的菌落特征、个体形态及其孢子的形态。

二、实验原理

放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝或孢子丝三种。

放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。

孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。

孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。

它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。

放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。

三、实验材料

1．菌种。

2．培养基 。

3．器皿：

培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀（或刀片）水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。

四、操作步骤

（一）插片培养法

1．取融化并保温在50℃的高氏1号培养基15-20ml，倒入9厘米的无菌皿中，冷凝成平板。

2．用接种环取放线菌孢子于无菌水中，制成孢子悬液。

3．用无菌吸管吸孢子悬液1滴于平板上，用无菌刮铲涂抹均匀。

4．取无菌盖玻片，倾斜的插入培养基中，每皿插入5-8片。

5．将平板倒置在28-30℃温箱中，培养3-4d。

6．取插片一张，用擦片纸擦去玻片一面的放线菌，微热固定。

7．在盖玻片上，滴加石炭酸复红染色1min，水洗风干。

8．镜检。

取干净载玻片一张，将染色的盖玻片面向下放在载玻片上。

在油镜下观察放线菌的菌丝（包括基内菌丝和气生菌丝）、孢子丝（有直形、波状菜、螺旋状等）和孢子形态。

（二）印片法

1．制备菌悬液和平板培养基同

（一）。

2．取菌悬液一环，在平板培养基上划线6-7次，置于28-30℃的温箱中培养3d。

3．取生长好的放线菌的培养皿，用接种针将菌苔和培养基切割成小方块，并用针穿过培养基挑起。

4．取一张干净载玻片，通过灯焰稍微加热，然后用针将菌苔表面轻轻地在玻片的不同部位压几次，在压菌苔时应避免和玻片摩擦搅乱印痕，影响观察。

5．将印片在灯焰上加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，风干。

6．镜检。

先用低倍镜观察，找到印痕，更换高倍镜观察，再用油镜观察放线菌的菌丝体、孢子丝及孢子的形态，并绘图。

五、实验结果

绘图描述放线菌形态

六、思考题

镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？

实验七霉菌个体、群体形态观察

一、目的要求

掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。

二、实验原理

霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：

直接制片观察法：

是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。

此染色液制成的霉菌标本片其特点是：

（a）细胞不变形；（b）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。

载玻片培养观察法：

此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。

这种方法可观察霉菌自然生长状态下的形态。

玻璃纸培养观察法：

为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。

此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。

三、实验器材

曲霉（Aspergillussp.），青霉（Penicilliumsp.），根霉（Rhizopussp.），乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基平板，无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，滤纸等。

四、操作步骤

（一）一般观察法

于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。

置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。

（二）载玻片观察法

1．将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min或干热灭菌，备用。

2．将6-7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0.5-1cm2的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。

3．用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。

4．在培养皿的滤纸上，加无菌的20％甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。

将培养皿置28℃培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。

五、实验结果

绘图说明你所观察到的霉菌形态特征。

六、思考题

比较四种霉菌形态上的异同。

实验八培养基的配制及湿热灭菌；玻璃器皿的干热灭菌

一、目的要求

1．明确培养基配制的原理，掌握制备培养的基本技术。

2．学习并掌握微生物实验室常用的两种灭菌方法——湿热灭菌法和干热灭菌法。

二、实验原理

人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的混合营养基质称为培养基。

培养基含有微生物所需的6大营养要素（水分、碳源、氮源、能源、矿质元素和生长素）和适宜的pH、渗透压及氧化还原电位等。

设计和制作培养基是研究微生物生命活动规律和利用微生物进行工业发酵生产必须的重要基础工作。

培养基成分与配比合适与否，对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物积累和生产工艺都有很大影响。

良好的培养基能充分发挥菌种的生物合成能力，以达到最佳的生产效果；相反，若培养基成分、配比或原料不合适，菌种的生长繁殖及发酵效果就差。

不同微生物的营养要求虽具有一定共性，但也存在许多差别。

只有根据微生物的营养理论，结合研究对象的特殊营养要求、代谢特点及培养目的，才能设计或选择出适宜的培养基。

　　在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基（Media）。

由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。

我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。

在微生物实验室中常用灭菌消毒方法有：

1．干热灭菌法：

火焰灭菌（灼烧灭菌）、干热灭菌

2．湿热灭菌：

巴氏消毒、煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌、实罐灭菌。

3．过滤除菌

4．放射线灭菌

其中，干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果

三、实验器材

1．器材：

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸、牛皮纸、记号笔、麻绳、吸管、培养皿、电烘箱、镊子等。

2．试剂：

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等。

四、操作步骤

（一）培养及的配制

称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查。

1．按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。

对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。

配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。

并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。

2．调节pH值。

用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。

3．过滤。

用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。

用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。

4．分装。

已过滤的培养基应进行分装。

如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。

如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。

分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。

分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。

装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。

一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4ml（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15ml。

每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。

5．加棉塞。

分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。

堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。

棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。

制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。

棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。

棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。

棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。

塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。

6．制作斜面培养基和平板培养基

　　培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。

（1）制作斜面培养基。

在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。

将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。

（2）制作平板培养基。

将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10ml，以铺满皿底为度。

铺放培养基后放置15min左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。

（二）干热灭菌

装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物。

用干热空气灭菌的方法。

常用的设备是电热干燥箱。

其法是先将洗净并晾干的玻璃器皿用包装纸包装好，置于干燥箱中（注意需灭菌的物品不要靠箱壁附近，不要过挤）。

打开电源开关，调节升温旋钮，使其缓慢升温至60-70℃时，开动鼓风开关，鼓风5-10min，以促使器皿上及干燥箱空间的水气排除。

继续转动升温旋钮，使温度升至160-170℃，维持2h。

控制温度的方法是当箱内温度升至160℃时，应将温度调节旋钮缓慢地反方向转动，当干燥箱上的指示灯红灯熄灭，绿灯亮时，再缓慢地来回转动温度调节旋钮，使红灯刚亮，绿灯刚灭处为止。

这样，可继续升温约5-10℃，即可将温度控制在165-170℃。

红灯是加热升温的信号，绿灯是切断加热电源的信号。

灭菌时间到了以后，将温度调节旋钮按反时针方向转动至“0”点。

关闭电源开关，待其冷却至50℃以下，方可取出灭菌器皿。

绝对不可在高温时打开箱门。

另外，干热灭菌时，定要专人看管，切勿同时干其他它事情，以免发生事故。

（三）高压蒸汽灭菌

加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查。

在一个大气压下，蒸汽的温度只能达到100℃，当加压时，随压力的增高温度也上升到100℃以上，根据这一原理设计了高压灭菌罐。

这是一个密闭的耐高压高温的金属容器，具有严密的盖，容器内的蒸汽不能漏出。

由于连续加热，蒸汽不断增加，因而灭菌器内的压力逐渐增大，同时也使容器内的温度随压力而升高。

使用高压灭菌器进行灭菌时，当压力上升到2或3磅/英寸2（不得超过5磅/英寸2）时，须缓缓打开气门，排除器内的冷空气，然后再关上气门，使器内的压力再度升高。

按规定要求进行灭菌。

若冷空气排不干净时，则压力虽达规定数字，而其内温度却实际不足，会影响灭菌的效果。

各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、工作服、橡胶用品等均可用高压灭菌器灭菌。

通常用15磅/英寸2（1.02公斤/厘米2）的压力，在121.3℃温度下经15-20min，即可杀死所有微生物及其芽孢，达到灭菌目的。

被灭菌物品的容量过大时，可相应的延长灭菌时间。

五、实验结果

写出你所用过的3-5种消毒灭菌方法。

六、思考题

1．高压蒸汽灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？

灭菌完毕后，为什么待压力降至“0”才能打开排气阀，开盖取物？

2．在使用高压蒸汽灭菌锅时，如何杜绝一切不安全的因素？

实验九微生物的分离和纯化

一、目的要求

1．学习但平板的方法。

2．了解微生物分离和纯化的原理。

3．掌握常用的分离纯化微生物的方法。

二、实验原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

本实验采用平板分离法：

该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：

1．选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

 2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

纯培养的确定：

 1．确定其菌落观察特征；

 2．结合显微镜检测个体形态特征的确定。

三、实验材料

1．培养基：

高氏I号培养基，无氮培养基，豆芽汁培养基，查氏琼脂培养基。

2．试剂：

10%酚液，盛9ml无菌水的试管，链霉素和土样

3．仪器或其它用具：

无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、显微镜、涂布器等。

四、方法步骤

流程：

倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。

（一）平板涂布法

1．倒平板。

将培养基加热溶化待冷至55～60℃时，分别倒平板，每种培养基倒3-5皿。

倒平板的方法：

右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

2． 制备土壤稀释液。

称取土样lg，放入盛10ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。

用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：

操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

3． 涂布。

将上述每种培养基的平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

4． 培养。

将培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

5 ． 挑菌落。

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。

若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

（二）平板划线分离法

1． 倒平板。

按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、样品编号和实验日期。

2． 划线。

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

3．培养

4．挑菌落

五、实验结果

分别记录并描绘四大类微生物生长情况和培养特征。

六