色谱分析中国药科大学 第4章 第16节 高效液相色谱分析.docx

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色谱分析中国药科大学第4章第16节高效液相色谱分析

色谱分析（中国药科大学）第4章第1-6节高效液相色谱分析

第四章高效液相色谱法

第一节概述

一、定义与分类

液相色谱是指流动相为液体的这类色谱法的总称。

高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。

根据固定相的不同，HPLC可分为以下几类：

1、液－固吸附色谱法

2、液－液分配色谱法

3、化学键合相色谱法

4、离子交换色谱法

5、离子对色谱法

6、凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法）

二、HPLC的特点和其它色谱法的比较

（一）与经典液相色谱比较

1、高分离效能

H=A+B/u+Cu（A=2

dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑）

经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。

2、快速，省时，省材料

经典柱色谱中的柱子多为一次性使用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。

3、灵敏度高，准确度高，可达1％的分析精度

柱色谱及薄层色谱（TLC）在进行定量分析时影响因素较多，故准确度及重现性均不如高效液相色谱。

HPLC与经典液相色谱的比较

HPLC

经典液相色谱法

色谱柱入口压力/MPa

高压，2-20MPa

柱口压力低,0.001～0.1

固定相粒度：

粒径/μm

2-5

>100

色谱柱柱效/（理论塔板数/m）

2000-50000

2-50

分析速度

分析速度快

分析速度慢

色谱柱使用情况

可重复多次使用

色谱柱只用一次

在线检测情况

能在线检测

不能在线检测

定性定量的准确度

好

差

（二）与GC比较

1、适合于热不稳定性样品的分析

GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团

2、有利于有机酸，碱等极性化合物的分离

这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析

3、可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物

这些物质无法气化，不可GC分析。

总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。

HPLC与GC的比较

GC

HPLC

挥发性物质，适用于20％的化合物

几乎可以分析各种物质

对热不稳定的物质不能分析

可以用于热不稳定的物质

用毛细管柱色谱可得到很高的柱效

色谱柱不能很长，柱效不会太高

载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性

固定相：

没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性

回收困难

可定量回收，可用于制备

第二节液－固吸附色谱及液－液分配色谱

一液－固吸附色谱（LSC）

（一）定义

色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normalphasechromatography，NPC）。

液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。

在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。

吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。

溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。

在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。

但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。

（二）固定相

液—固吸附色谱固定相分类如下：

优点：

比表面积大，样品容量大（mg/g）

HPLC中液—固吸附色谱固定相用的主要是硅胶。

其次是氧化铝。

结构类型主要采用薄壳型及全为多孔微粒型两种。

薄壳型及全为多孔微粒型硅胶的示意图

硅胶表面上的活性作用点：

液—固吸附色谱的保留机理：

极性。

极性小的组分先出峰（正相色谱）。

液—固吸附色谱样品的分离主要是因分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点（如硅醇基）之间的相互作用，这种极性相互作用的强弱归纳如下：

硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类

吸附强弱

样品类型

无吸附

脂肪烃

弱吸附

烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、卤代烃

中等吸附

绸环芳烃、醚、腈、硝基化合物和大多数羰基化合物

强吸附

醇、酚、酰胺、亚胺、砜、酸

一般规律

1.F化物＜Cl化物＜Br化物＜I化物

2.顺式比反式几何异构体保留值大

3.官能团之间的分子内氢键将使保留值减小

4.极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小

5.环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端取代基有更强的保留

例如：

环丙氟哌酸的中间体2，4—二氯氟苯的合成工艺如下：

（1）

（2）（3）

（4）（5）

现对合成的最终产品2，4—二氯氟苯进行纯度检查。

采用的检查方法为HPLC，以硅胶柱分析得到如下色谱。

试判断图中各峰所对应的化合物（归属）。

（三）流动相

LSC中使用的流动相为各种有机溶剂，主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机溶剂（如二氟甲烷、甲醇、二乙胺等）作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及PH值，即进行所谓正相色谱、极性越大的组分保留时间越长。

1.混合溶剂

液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不同的溶剂强度。

但他们不一定是进行LSC的最佳溶剂强度。

我们可以利用不同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。

流动相主体：

弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。

改性剂：

调节流动相的洗脱强度与峰形。

中等极性：

二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。

极性溶剂：

四氢呋喃、乙腈、异丙醇、甲醇、水等。

碱性物质：

如三乙胺等→分离碱性样品，避免峰拖尾或不可逆的保留。

2.水的影响

硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。

水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活性大大降低。

（四）液—固色谱的应用

随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用LSC模式的分离分析被更方便、稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方面仍有其独特的意义：

1.异构体的分离

许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的，而采用以硅胶为固定相的LSC却很容易分开。

2.样品预处理

许多生物样品可使用经典LSC来进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进一步以GC或HPLC等分离分析。

3.制备色谱

由于硅胶比较便易。

所以进行分离比较有利，同时流动相为有机溶剂，容易挥发。

便于产物提取。

4.常用于HPLC-GC联用技术

由于流动相为有机溶剂，易于汽化，所以目前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用LSC，进行正相HPLC。

二、液-液分配色谱法（LLC）

（一）定义

色谱分离是基于样品组分在固定液和流动相之间分配的不同色谱法称为液-液分配色谱法。

这种方法的基本原理是物质在两种液相间的分配。

它类似于实验中常用的液-液萃取法。

其保留机理为溶解度。

物质在固定液中的溶解度越大，保留时间越长。

（二）固定相

LLC的固定相为载体上涂渍的固定液。

1.载体

原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体。

一般常用硅胶，硅藻土等。

结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种。

多孔层微珠是较早使用的一种载体，它柱效好，分析时间短；但它的多孔层很薄，只能涂渍少量固定液（最大涂渍1~2%），故柱容量低，柱稳定性也差，因为少量的固定液流失将大大改变保留体积。

全多孔微粒（如硅胶）孔容大（≈1ml/g），可涂渍较多的固定液，涂渍量可达1克固定液/每克载体（称为100%涂渍），其柱效比前者高，且柱容量高，柱子稳定性也好——载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著，理想的载体应该具有如下特点：

1）孔容大

2）孔径应为100~500埃之间，孔径太小较大的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离不佳。

孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔内保持的好。

2.固定液

固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。

然而，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和其他醚。

所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂。

但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。

LLC的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系。

如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是不溶解的。

3.载体的涂渍

采用GC中常用的固定液涂渍方法。

（三）流动相

采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相使用前需预先用固定液饱和，或在分析柱前增加预饱和柱，以避免固定液流失。

（四）应用

LLC较适合于分离中等极性和极性物质，这些物质对LSC来说极性太高，LLC的应用范围几乎全被键合相色谱所包含，故现在已很少使用。

三、正相硅胶反相洗脱（NS/RE）色谱法

（一）固定相

本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。

常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。

该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH,离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。

（二）流动相

该法常用的流动相为：

乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：

15）或（80：

20）。

该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。

色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。

适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。

影响NS/RE色谱保留的因素如下：

1.水的比例增加，洗脱能力减小；

2.三乙胺浓度升高，对含碱性基团组分的洗脱能力提高，保留时间缩短。

流动相中三乙胺为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消除硅羟基对生物间的吸附。

3.pH值对NS/RE的色谱保留具有两面性。

一方面，增大pH值，硅醇基解离程度提高，离子交换特性增强，使保留时间增大。

但另一方面，对于碱性化合物，增大pH会压制该化合物的解离，反而会使保留时间缩短。

流动相的pH值以pH6~7为好。

原因有三：

（1）pH太低，硅羟基失去离子交换能力。

（2）pH值太高弱碱性药物不易离子化。

（3）pH值太高，硅叫在碱性溶液中有一定的溶解度。

4.非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于RP-HPLC（硅氧烷基疏水）

（三）柱子的培养

由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上。

很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以0.1%冰乙酸冲洗15-20min,洗去三乙胺，然后再用甲醇冲洗20min。

经这样处理后，柱压可长期保持不变，达到保护柱子的目的。

第三节化学键合相色谱

一、意义和特点

化学键合相色谱使用的固定相是借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上的，主要用于反相、正相、离子交换及离子对色谱中。

据统计。

键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。

要形成化学键合固定相，有两个必要条件：

一是所用的担体材料应有某种化学反应活性，如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化学反应的官能团；但以硅胶为最理想的和最常用。

二是有机分子应含有能与担体表面发生反应的官能团（详见下节讨论）。

硅胶（SiO2·xH2O）之所以是理想的化学键合相担体，主要由它的表面性质所决定。

硅胶表面硅原子主要以硅醇基（≡Si-OH）和硅氧烷形成存在，这种硅醇基是进行键合的活性官能团。

自由型硅醇基硅氧烷型

按照晶体点阵计算，硅胶表面羟基数目可达到8个/nm2,但用化学方法测定的羟基数一般认为是约5个/nm2。

硅胶表面存在着足够的可反应硅胶基，再加上硅胶本身的许多特点，例如强度好，孔结构和表面积易于人为控制，有较好的化学稳定性等，因而是各种化学键合相理想基质材料。

化学键合相在HPLC中的应用，引起了一场巨大的变革。

使得较早出现的液-固吸附色谱及液-液分配色谱大量地被键合相色谱所取代，某些离子型的物质也从用传统的离子交换树脂分离改用离子交换键合相或反相离子对色谱分离。

归纳起来，化学键合相主要有以下几个优越性。

1.消除了担体上的表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。

这样就缓和了一些复杂样品在固定相表面上的不可逆化学吸附，使得操作简化，峰形对称；对溶剂中微量水分含量的变化要求不苛刻；此外，溶剂的残留效应小，梯度冲洗平衡快。

这是键合相色谱在许多方面取代液固吸附色谱的主要原因。

2.耐溶剂冲洗。

这是传统的液-液分配色谱（LLC）逐渐被键合相色谱取代的根本原因。

LLC中固定液的流失十分严重，为了克服这个缺点，曾采取溶剂预先用固定液饱和及柱前增加预饱和柱的方法，但这样做既不方便，柱系统的稳定性也差。

化学键合相色谱的固定相永久性的键合在担体上，不会流失。

3.热稳定性好

每种键合相均有其相应的最高使用温度，在此温度下可进行升温HPLC。

如十八烷基键合相的流失温度在220℃以上。

4.表面改性灵活，容易获得重复性产品

。

改变键合用有机硅烷，可得到不同的键合相填料，以适用于各种类型的试样分离。

控制硅胶的质量和键合工艺，可得到重复性产品。

二、制备和性能评价

（一）制备

在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸处理，使表面的硅氧烷键打开，形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。

酸处理也可除去表面层的金属氧化物杂质和孔隙中的细粉。

然后中和，在200℃以下烘干除去物理吸附水（不得超过200℃，否则硅醇基脱水形成硅氧烷结构），再以过量的硅烷化试剂进行化学键合。

（1）反应

键合反应的类型：

Si-O-Si-C键型（硅胶与有机硅烷反应产物）

这是一类目前占绝对优势的键合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，能在pH2～7.5的介质中使用。

它是利用氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶反应而得。

X为Cl、CH3O或C2H5O。

R为辛烷基、十八烷基、苯基等。

如Bondapak-C18键合相，即为R=十八烷基。

X：

-Cl、-OH、-OCH3、-OC2H5

R：

-C8H17、-C18H37、-（CH2）nCN、-（CH2）nNH2

（2）端基封尾（endcap）－－消除残余的硅羟基

由于空间位阻的缘故，较大的硅烷分子不可能与担体表面上较小的硅醇基全部发生反应。

因而残余羟基是不可避免的。

为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用一氯三甲基硅烷或六甲基二硅氨烷钝化。

也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。

（3）常见的官能团

十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）

氰基

苯基

氨基

（4）常用的键合相商品牌号

安捷伦公司（Agilent）：

Zorbax®：

Zorbax®由著名的色谱科学家Kickland研制，并由杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的注册商标。

现在，Zorbax的全部生产线已并入Agilent公司。

Waters公司：

Bondapak®、μBondapakTM、XterraTM：

μBondapakTMC18性能重现性非常好。

能经历20多年但性能基本上保持一致的HPLC并不多，μBondapakTMC18是其中一个代表性的品种。

瑞典AkzoNobel公司：

Kromasil®：

Kromasil硅胶的质量较稳定，但柱压较高。

Merck公司：

LiChrosorb、LiChrospher、Nucleosil

（二）化学键合相性能评价

由于各种键合相均以硅胶为基质，可以认为是一种改性硅胶。

在化学键合相色谱中，代表色谱保留ｋ＇是与键合在硅胶表面有机基团的覆盖量直接有关，因而键合相表面改性的完全程度和重现性是色谱用户和制造厂家共同关心的。

重复性和改性完全程度可通过残余羟基，覆盖度和覆盖均匀性表示。

测定和评价的方法有微量元素分析、色谱、光谱、核磁共振法等。

1．微量元素分析或热失重法

本法直接测定键合相的碳含量：

这个值在２～２９％之间变化。

由于Ｃ％随基质比表面积（Ｓ）和键合有机基团的分子量（Ｍ）变换，所以在研究和比较的工作中采用表面键合相浓度α表示，即单位表面积所含键合相的浓度（umol/m2）

：

=

式中，w为1g担体上键合有机物的重量（μg）；M为键合有机基团的分子量；S为担体比表面积（m2/g）。

W用碳含量表示：

W=

106

式中，12为碳的原子量；Nc为键合有机基团的碳数。

有时也用表面覆盖度表示键合量。

表面覆盖度=

=

=

这里假定硅胶表面可反应的硅胶基数目为5个/nm2，6.02×1017为以微摩尔为基准的阿佛加德罗常数。

2.色谱法

键合相的性能用色谱方法评价是很自然的，因为它最终用于色谱，所以生产厂家一般都给出产品附上特定标准物苯及联苯的保留值和柱效率，或者其它参数的测试结果。

例如对反相填料在甲醇-水条件下考察对芳烃、苯、萘、联苯的分离情况。

也有人提出用非极性键合相填料正相洗脱的方法检查残余羟基的含量，即用庚烷作流动相。

若残余羟基甚少，则象甲醇、丙酮等极性化合物的保留时间与tm相近。

且峰形对称。

若残余羟基甚多。

则情况相反。

这种方法评价较为多客观。

3.光谱法

光谱法也是考察填料表面羟基含量的重要手段。

这是基于Si-OH基在3750cm-1处有特征的红外吸收谱带，借此可以获得某些信息。

三、分类

化学键合相的分类可以有不同的依据。

按键合相的表面结构分为单分子键合和聚合键合；按键合有机硅烷的官能团分为极性键合相、非极性键和离子交换键合相三种。

四．极性键合相色谱

极性键合相指键合有机分子中含有某种极性基团。

和空白硅胶相比，这种极性键合相的表面能分布相对均匀，因而吸附活性比硅胶低，可以看成是一种改性过的硅胶。

最常见的极性键合相有氰基（-CN，Cyano-）、二醇基（diol）、氨基（-NH2，amino-）等。

商品键合相一般均以上述基团命名，如LichrosorbNH2，u-BondapakCN等。

也有的商品键合相并不注明是什么基团。

对于极性键合相来讲，一般键合表面由三部分组成：

键型、主体基团、极性端基。

键型：

如Si-O-Si-C。

它是整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。

主体基团：

一般由直键烃基或醚基所组成，其作用为使硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定距离。

极性端基：

由带极性基团（如NH2，ＯＨ）的烃基或芳基组成。

大多数情况下，极性键合相的制备分三步进行。

第一步是在硅胶表面先接一个正烃基或正芳基硅烷，然后再以相应的取代反应引入极性基团。

由于空间位阻的影响，上述反应不能象相似相溶液那样完全，一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程度。

上述三种极性键合相都是一氢键力作用，其中氰基是一种氢键接受体，而后两种兼具氢键接受体和给予体两种性能。

对于有较强氢键作用力的样品，在后两种键合相上的保留值大，所得ｋ＇值也大。

极性键合相一般都用作正相色谱，即用非极性或极性小的溶剂（如烃类溶剂）加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇类、乙腈等），以调节控制洗脱液的洗脱强度。

分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同，即极性弱的先出峰，极性强的后出峰。

但对强极性的化合物，上述极性键合相也可用反相色谱，如分离糖类或多肽化合物时，用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好的分离效果。

极性键合相的保留机理既有吸附的因素，也有分配的因素。

一般认为吸附过程是主要的相互作用过程，通过填料表面极性基团的偶极诱导，或氢键，或静电作用和溶质分子发生相互作用，达到分离目的。

极性键合相色谱提纲：

1、键合表面的基团组成

键型：

Si-O-Si-C或Si-O-Si-N

主体基团：

直链烃基或醚基

极性的端基：

氨基（-NH2）、氰基（-CN）、二醇基（diol）、芳硝基、醚基

LiChrosorbNH2、LiChrosorbDiol

2、分离机理

作用力：

氢键力

氰基：

氢键接受体

氨基、二醇基：

氢键接受体与给予体

联苯胺、苯胺k’:

氨基>氰基（学生思考原因）

3、色谱分离方式

1）一般用作正相色谱

流动相：

弱极性溶剂＋适量极性溶剂

（烃类）（氯仿、醇、乙腈）

溶质保留规律：

A溶质的分离是基于亲水结构的差异；

B溶质的极性越大，保留值越大；

C流动相极性越大，洗脱强度越大。

2）也用作反相色谱

分离样品：

强极性化合物，如糖类、多肽

五．离子交换键合相色谱

离子交换色谱早期都采用高分子聚合物（如聚苯乙烯树脂）为基质的离子交换树脂作用定相。

在HPLC中，这种固定相由于溶胀性，不耐高压，以及表面的微孔型结构影响传质速率，现已被离子交换键合相所代替。

在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交换基团，便成了离子交换键合相。

若带上磺酸基（-SO3）,羧酸基（-COOH），就是阳离子交换剂，若带上季氨基（-R4N+）或氨基（-NH4）就是阳离子交换剂。

离子交换键合相多以薄壳型或全多孔微粒硅胶为基质，具有较高的耐压性，化学及热稳定性。

由于有较好的机械强度，耐压，这类微粒型键合相可以高压匀浆装柱。

但它们的pH适用范围只能在pH2~8。

pH＞9时，硅胶便容易溶解。

特别是未键合的残留硅羟基容易生成硅酸盐。

离子交换容量是很重要的。

交换容量越大，负载能力越大，ｋ＇值也越大。

离子交换键合相的交换容量与固定相的表面积直接有关。

全多孔微粒型固定相的交换容量较大，一般为毫克当量水平（0.2~0.5毫克当量/克）；薄壳型由于表面积较小，一般只有微克当量级（30~60微克当量/克）。

交换容量可用酸碱滴定法测定。

在离子交换键合相色谱中，离子交换键合相色谱的流动相多为控制一定的pH的缓冲液。

流动相中往往加入有机成分作为改性剂。

溶质的保留值受流动相的pH值、离子强度以及有机改性剂的影响，溶质的保留兼有离子交换和吸附双重机理。

1.pH值对保留时间的影响

弱酸及弱碱的保留值与洗脱液的pH值有关，它们或者先解离并参加离子交换而被分离；或者不解离。

不参加离子交换，而以分子形式几乎无保留地通过柱子（实际上由于极性基团微弱的吸附作用而产生很小的保留作用）。

在强阴离子交换键合相上分离弱酸性有机阴离子时，当pH过高（如pH＞7时），有机酸完全电离