成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究.docx

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成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究

成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

杨京，赵子瑜，何启芬，陈林【摘要】目的本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化，为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。

方法8周龄雄性C57小鼠和FGFR3功能持续增强的软骨发育不全（Ach）小鼠各6只，分为脂多糖（LPS）组和生理盐水对照组，每组3只。

LPS15mg/kg或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧胫骨提取RNA，定量聚合酶链式反应（PCR）检测白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、骨钙素（OC）的变化。

LPS、碱性成纤维生长因子（bFGF）处理前成骨细胞系MC3T3E14小时后定量PCR检测IL6、TNFα、OC水平，成骨诱导7天后检测碱性磷酸酶（ALP）活性。

结果LPS刺激后，骨组织和MC3T3E1的炎症递质基因IL6、TNFα的RNA水平显著增加（P0.01），成骨标志性基因OC表达下调（P0.05）。

且Ach小鼠相应基因变化幅度显著高于C57的变化幅度（P0.05）。

MC3T3E1同时用LPS与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）处理组的IL6、TNFα、OC水平表达水平位于单独用LPS或bFGF组之间。

成骨诱导7天后LPS处理组细胞ALP活性显著低于未处理组（P0.05），bFGF处理组显著增高（P0.01）。

结论LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。

在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应，在细胞水平低剂量bFGF激活FGFR3减轻上述反应。

【关键词】脂多糖;骨;成骨细胞;成纤维细胞生长因子受体3　　Abstract：

ObjectiveThisexperimentfocusesonthedifferentiationofosteoblastsintheendotoximiawhiletheFGFR3pathwayisactivating,soastounderstandthechangeofbonetissueininflammation.MethodsSixmaleC57miceand6maleAchmice（persistentlyactivatingfunctionofFGFR3）,8weeksold,weredividedintonormalsaline（NS）groupandlipopolysaccharide（LPS）group,3micepergroup.RNAwasextractedfromtherighttibias4hoursafterLPSorphysiologicalsalineinjection,andthenthelevelsofinterleukin6（IL6）,tumornecrosisfactorα（TNFα）,osteocalcin（OC）intibiaandosteoblastweremeasuredbyquantitativerealtimePCR.FourhoursafterthepreosteoblastcelllineMC3T3E1wasculturedwithLPSandbFGF,thelevelsofIL6,TNFα,OCintibiaandosteoblastalsoweremeasuredbyquantitativerealtimePCR.TheMC3T3E1activitiesofalkalinephosphatase（ALP）weredetected7daysafterculture.ResultsBothofthelevelsofIL6andTNFαintibiasandMC3T3E1wereincreasedwhilethelevelsofOCintibiasandMC3T3E1weredecreased4hoursafterLPSadministration（P0.01）.TheexpressionchangewasmorehugeinAchmice（P0.05）.TheexpressionsofIL6,IL1andOCinMC3T3E1culturedwithLPSandbFGFwerehigherthanthoseculturedonlywithLPSandlowerthanthoseonlywithbFGF.Comparedwiththeuntreatedgroup,theactivityofALPinMC3T3E1wasdecreasedinLPSgroup（P0.05）andincreasedinbFGFgroup（P0.01）.ConclusionLPScouldinvolvebonetissueininflammationandinhibitthedifferentiationofosteoblast.PersistentlyactivatingthefunctionofFGFR3invivocouldaggravatetheseeffects.AndlowdoseofbFGFinvitrowhichactivatesFGFR3couldrelievetheseeffects.　　Keywords：

LPS;bone;osteoblast;FGFR3　　脂多糖（LPS）是脓毒症中主要致病菌革兰阴性菌的主要致病成分。

LPS可引起多种脏器损伤、功能紊乱甚至衰竭。

但骨骼在LPS引起的内毒素血症中的变化和发生机制尚未完全阐明。

我们在前期的研究中利用全基因组基因芯片扫描发现，LPS注射4小时后小鼠骨组织中成纤维生长因子受体3（FGFR3）表达显著下调。

有研究发现成年期FGFR3敲除小鼠骨质减少，并且体外培养的骨髓间充质细胞向成骨分化增强[1]。

这提示FGFR3可负性调节成骨细胞的分化。

但有文章发现在细胞培养实验中LPS抑制成骨细胞的分化[2]。

那么LPS引起的FGFR3表达下降是否为机体的代偿反应?

本实验将通过在动物、细胞水平增强FGFR3信号通路后检测LPS刺激下成骨细胞分化的变化，以初步明确FGFR3信号通路在骨组织对LPS反应中的作用，为进一步阐明骨组织在炎症反应中的变化奠定基础。

　　　　材料与方法　　1动物分组　　8周龄雄性C57小鼠和Ach小鼠各6只，分为LPS组和生理盐水（NS）对照组，每组3只。

LPS15mg/kg（Sigma）或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧全长胫骨，剔除肌肉、软组织后液氮保存备用。

　　2细胞培养　　前成骨细胞系MC3T3E1（购自北京协和细胞库）以含10%FBS（GIBCO）的αMEM（GIBCO）培养至融合后，以LPS100ng/ml（sigma）、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（BD）、LPS100ng/ml+bFGF10ng/ml分别处理细胞4小时后搜集细胞备用。

另取融合细胞用成骨诱导液培养：

含50μg/ml维生素C（sigma）、10mmol/Lβ磷酸甘油钠（sigma）、100nmol/L地塞米松（sigma）的完全培养基。

以100ng/mlLPS、bFGF10ng/ml、LPS100ng+bFGF10ng/ml分别处理7天后搜集细胞备用。

每组实验重复2次，相同培养条件下以不加任何处理因素的细胞作为空白对照。

　　3定量聚合酶链式反应（PCR）　　将相应时间点所取的上述胫骨组织和培养细胞以Trizol法提取总RNA。

紫外分光光度仪测取RNA浓度，取1μg总RNA为模板,参照逆转录试剂盒（Exscript,TAKARA）的说明书进行逆转录反应。

cyclophilinA、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、骨钙素（OC）引物由上海生工生物工程公司合成（表1）。

PCR反应体系配制及扩增条件设置参照定量PCR反应试剂盒说明书进行（SYBRPrimerExTaqkit,TAKARA）。

最后，由定量PCR仪（Mx3000P）自动给出c（t）值和目的基因的相对含量。

　　4碱性磷酸酶（ALP）活性检测　　参照ALP活性检测试剂盒（sigma）进行。

成骨诱导7天细胞以裂解液：

10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸（TrisHCl），2mM氯化镁，0.05%TritonX100（pH8.2）裂解后吸取30μl上清加入至300μlALP活性测定液中，颠倒混匀后在37℃反应30分钟，加入1ml0.1N的NaOH中止反应，测定405nm的吸光值，以0.4N的HCl作对照。

同时吸取30μl上清加入至70μl生理盐水中，然后加入1mlBCA工作液，混匀后37℃反应30分钟，测定562nm的吸光值，以100μl生理盐水作对照。

每个样品取其OD405/OD562的比值做统计分析。

　　5统计分析　　使用SPSS10.0统计软件，采用OneWayANOVATukey法比较组间差异，以P0.05为差异显著。

表1定量PCR引物序列　　结果　　1FGFR3在LPS引起的炎症反应中的作用　　LPS刺激后，与生理盐水组比较，胫骨组织和MC3T3E1细胞的炎症递质基因TNFα、IL6的表达水平显著增加（P0.01）（图1）。

且Ach小鼠胫骨组织LPS处理后TNFα、IL6的表达水平增幅显著高于C57的变化幅度。

bFGF处理MC3T3E1细胞4小时后其TNFα、IL6表达水平略有增加，同时用LPS与bFGF处理后其IL6、TNFα水平表达水平有所增加，但低于单独用LPS处理组（图1）。

　　2FGFR3在LPS引起的成骨细胞分化抑制中的作用　　LPS处理后胫骨组织和MC3T3E1细胞的成骨标志性基因OC表达显著低于生理盐水组（P0.01）。

Ach小鼠胫骨组织LPS处理后OC表达水平下降幅度显著高于C57小鼠的降幅（图2a）。

bFGF处理MC3T3E1细胞4小时后其OC表达水平显著高于空白对照组（P0.01），同时用LPS与bFGF处理后其OC水平表达水平增加（P0.01），但略低于单独用bFGF处理组的表达水平（图2b）。

　　成骨诱导7天后，与空白对照组的ALP活性比较，LPS处理细胞下降（P0.05），bFGF处理组显著增高（P0.01），同时用LPS与bFGF处理组虽略低于单独用bFGF处理组的ALP活性但仍显著高于空白对照（P0.01）（图2c）。

　　　讨论　　近年来研究发现骨骼不仅是人体的支撑结构，其更重要的功能是作为一种内分泌免疫器官调节全身内环境的稳定。

成骨细胞可通过分泌OC调节体内血糖水平[3]。

炎症反应时成骨细胞在多种炎症因子的刺激下会产生各种细胞因子，如高迁移率组蛋白B1（HMGB1）、IL6、激活核因子NF-κB受体的配体（RANKL）等，参与免疫应答[4]。

另外成骨细胞的分化成熟与造血干细胞增生密切相关。

表达于幼稚成骨细胞的骨桥蛋白（OP）可帮助造血干细胞定位于骨内膜表面，负性调节其更新[5，6]。

因此，研究骨骼在内毒素血症情况下的变化可能对机体的预后和转归具有重要的意义。

　　我们在前期的研究中利用全基因组基因芯片扫描发现，LPS注射4小时后小鼠骨组织中FGFR3表达显著下调。

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