高三生物考前三个月知识专题强化练专题12doc.docx
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高三生物考前三个月知识专题强化练专题12doc
[直击考纲] 1.基因工程的诞生（Ⅰ）。
2.基因工程的原理及技术（Ⅱ）。
3.基因工程的应用（Ⅱ）。
4.蛋白质工程（Ⅰ）。
5.植物的组织培养（Ⅱ）。
6.动物的细胞培养与体细胞克隆（Ⅰ）。
7.细胞融合与单克隆抗体（Ⅱ）。
8.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础（Ⅰ）。
9.胚胎干细胞的移植（Ⅰ）。
10.胚胎工程的应用（Ⅱ）。
11.转基因生物的安全性（Ⅰ）。
12.生物武器对人类的威胁（Ⅰ）。
13.生物技术中的伦理问题（Ⅰ）。
14.简述生态工程的原理（Ⅱ）。
15.生态工程的实例（Ⅰ）。
考点34 基因工程与蛋白质工程
判断下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述
（1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶，用前者可切割烟草花叶病毒的核酸（ × ）
（2）每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点（ √ ）
（3）应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达（ × ）
（4）自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程（ × ）
（5）从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。
目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽（ √ ）
（6）采用蛋白质工程进一步改造AFB1解毒酶的基本途径是：
从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（ √ ）
1．掌握基因工程的主干知识图解
（1）目的基因的获取
（2）基因表达载体的构建（目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因）
（3）将目的基因导入受体细胞
导入植物：
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
导入动物：
显微注射法导入微生物
导入微生物细胞：
感受态细胞法（用Ca2＋处理）
（4）目的基因的检测与鉴定
插入检测：
DNA分子杂交
转录检测：
DNA—RNA分子杂交
翻译检测：
抗原—抗体杂交
个体水平检测：
抗性接种实验
2．基本工具
项目
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两个核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键
作用特点（条件）
识别特定的核苷酸序列；在特定位点上切割
E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端
能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；有多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基因
3.基因表达载体的构建过程
1．利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是（双选）（ ）
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
答案 AD
解析 A项，过程①是通过逆转录获取DNA，逆转录过程需要用到逆转录酶。
B项，过程②指的是从cDNA文库中获取目的基因，不需要利用PCR技术，也用不到解旋酶。
C项，过程③中使用的感受态细胞要用CaCl2溶液制备，而不是用NaCl溶液制备。
D项，过程④鉴定目的基因是否已经导入受体细胞，可以用标记的目的基因为探针来检测受体细胞中是否存在目的基因，即利用DNA分子杂交鉴定。
2．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述，正确的是（ ）
A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
答案 D
解析 A项，②为重组Ti质粒，其构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与。
B项，含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的目的基因整合到受体细胞（④）的染色体上，而并非整个重组Ti质粒整合到④的染色体上。
C项，目的基因导入受体细胞后不一定能进行表达，所以抗虫基因导入植物细胞后，培育成的植株也不一定具有抗虫性状。
D项，转基因抗虫植株是否培育成功，可以从个体水平上进行检测，即观察植株是否具有抗虫性状，如果具有抗虫性状则说明发生了可遗传变异（基因重组）。
3．下列关于基因工程技术的叙述，错误的是（多选）（ ）
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
答案 ABC
解析 A项，限制性核酸内切酶大多特异性地识别6个核苷酸序列，但也有少数限制性核酸内切酶能识别4个、5个或8个核苷酸序列。
B项，PCR反应中温度周期性变化是为变性、复性和延伸创造条件。
另外，耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用，变性和复性过程不需要酶的催化。
C项，载体质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因。
D项，目的基因导入受体细胞后不一定能正常表达。
4．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。
现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：
C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
下列分析中正确的是（ ）
A．若用限制酶MspⅠ完全切割图1中DNA片段，会破坏2个磷酸二酯键
B．若图1所示DNA虚线方框内的碱基对被T－A替换，用限制酶SmaⅠ完全切割后会产生3种不同的DNA片段
C．若切割图2中的质粒以便拼接目的基因D应选择限制酶BamHⅠ和MboⅠ
D．若用上述条件构建含有目的基因D的重组质粒并成功导入细菌体内，则此细菌在添加抗生素A和B的培养基中不能存活
答案 D
解析 由题意可知，图1中的目的基因含有2个限制酶MspⅠ的切割位点，完全切割后会破坏4个磷酸二酯键，故A错误；若图中碱基对被替换后，限制酶SmaⅠ的切割位点只有1个，完全切割后能产生2种不同的DNA片段，故B错误；若切割图2中的质粒，并且不能破坏目的基因，最好选择限制酶BamHⅠ进行切割，故C错误；由于插入目的基因后会破坏抗生素A抗性基因，但没破坏抗生素B抗性基因，故在含有抗生素A和抗生素B的培养基中不能存活，D正确。
5．植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。
若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
（1）理论上，基因组文库含有生物的__________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。
（2）若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。
（3）将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。
要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的____________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的__________是否得到提高。
（4）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了________________________（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。
答案
（1）全部 部分
（2）筛选 （3）乙 表达产物 耐旱性 （4）同源染色体的一条上
解析
（1）基因组文库含有生物的全部基因，而cDNA文库中含有生物的部分基因。
（2）植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，包含该生物的所有基因，然后再从中筛选出所需的耐旱基因。
（3）若从植物甲中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，通常采用的方法是农杆菌转化法。
将耐旱基因导入植物乙的体细胞后，经过植物组织培养得到再生植株。
要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测该耐旱基因是否合成了相应的蛋白质，即检测此再生植株中该基因的表达产物，如果检测结果呈阳性，说明已经合成了相应的蛋白质，这时再进行个体生物学检测，即在田间试验中检测植株的耐旱性是否得到提高。
（4）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱和不耐旱植株的数量比为3∶1，符合基因的分离定律，说明得到的二倍体转基因耐旱植株为杂合子，因此可推测该耐旱基因只整合到了同源染色体的一条上。
6．人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。
流程如下：
（1）htPA基因与载体用________________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。
检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用____________技术。
（2）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其______________。
采集的精子需要经过________，才具备受精能力。
（3）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是____________，为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。
利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。
（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。
答案
（1）同种限制性核酸内切酶（或同种限制酶） DNA分子杂交（或核酸探针）
（2）超数排卵 获能（处理） （3）显微注射法 性别鉴定 全能性 （4）htPA（或人组织纤溶酶原激活物）
解析
（1）用同种限制性核酸内切酶对目的基因和载体进行切割，以形成相同的黏性末端。
检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，常用DNA分子杂交技术。
（2）对供体母羊注射促性腺激素可以使其超数排卵，采集的精子需要经过获能处理后才具备受精能力。
（3）将重组表达载体导入受精卵（动物细胞）常用的方法是显微注射法。
为了获得母羊，需要对胚胎进行性别鉴定。
利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，依据的原理是早期胚胎细胞的全能性。
（4）目的基因成功表达的标志是在转基因母羊的羊乳中检测到htPA，即人组织纤溶酶原激活物。
7．下面是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
请据图回答：
（1）获得A有两条途径：
一是以A的mRNA为模板，在________的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的______________序列，再通过化学方法合成所需基因。
（2）利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
（3）由A和载体B拼接形成的C通常称为__________________________。
（4）在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是_________________________________。
答案
（1）逆转录酶 DNA聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸
（2）引物 （目的基因或A基因）模板 （3）基因表达载体 （4）使其成为感受态细胞，使大肠杆菌更容易吸收重组DNA分子
解析
（1）利用逆转录法合成目的基因的过程是：
以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：
根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。
（2）PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。
（3）目的基因和载体结合，形成基因表达载体。
（4）在利用大肠杆菌做受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，有利于其吸收重组DNA分子。
考点35 细胞工程
判断下列有关细胞工程的叙述
（1）在“羊胎儿皮肤组织块→成纤维细胞”过程中，需要用胰蛋白酶处理，在培养过程中，将成纤维细胞置于5%CO2的气体环境中，CO2的作用是维持培养基的pH稳定，另外为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换培养液（ √ ）
（2）不同种植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程，该技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂种（ √ ）
（3）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞，克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变（ × ）
（4）二倍体细胞和恶性细胞系一样传代培养次数通常是无限的（ × ）
（5）二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株，若用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子（ × ）
1．植物体细胞杂交与单克隆抗体制备过程比较
步骤
植物体细胞杂交过程
单克隆抗体制备过程
第一步
原生质体的制备（酶解法）
正常小鼠免疫处理
第二步
原生质体融合（物、化法）
动物细胞融合（物、化、生物法）
第三步
杂种植株的筛选与培养
杂交瘤细胞筛选与培养
第四步
杂种植株的诱导与鉴定
单克隆抗体的提纯
相同点
①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可称为克隆，都不涉及减数分裂；②均为无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
（1）诱导融合的方法分别有哪些？
融合的细胞类型有哪几种？
提示 ①诱导植物体细胞的原生质体融合的方法主要有离心、振动、电激或用聚乙二醇作为诱导剂。
②动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒（诱导动物细胞融合的特有因素）、电激等。
融合的细胞类型：
前者—AA、BB、AB。
后者—瘤瘤、B瘤、BB。
（2）各自的原理分别有哪些？
提示 前者有细胞膜的流动性和植物细胞的全能性，后者有细胞膜的流动性和细胞增殖。
2．掌握克隆动物培育流程图
D个体的性别、性状与哪个个体相同？
提示 根据发育成新个体D的重组细胞核由动物B提供，而性别及大多数遗传性状是由核内遗传物质决定的，故B、D两者的性别及大多数遗传性状相同。
1．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（ ）
A．连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型
B．某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞
C．由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆
D．未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状
答案 B
解析 A项，连续细胞系的细胞一般都培养了多次，二倍体核型发生了改变，大多数细胞具有异倍体核型。
B项，细胞癌变是由基因突变引起的，如果癌细胞在一定条件下（如用秋水仙胺等药物治疗），则有可能恢复成正常细胞。
C项，细胞克隆的最基本的要求是：
必须确定所建立的克隆来源于单个细胞。
D项，未经克隆化培养的细胞系具有异质性。
2．下图表示四倍体兰花叶片通过植物组织培养成植株的过程，下列相关叙述中正确的是（双选）（ ）
A．①～③过程中发生了有丝分裂和减数分裂
B．①阶段需要生长素而③阶段仅需要细胞分裂素
C．①阶段为脱分化过程
D．此兰花的花药离体培养所得的植株体细胞有两个染色体组
答案 CD
解析 ①②③过程均发生了有丝分裂。
植物组织培养的各个阶段均需要生长素和细胞分裂素刺激。
①阶段细胞失去分化状态变成愈伤组织，为脱分化过程。
兰花是四倍体，花粉细胞含两个染色体组，经离体培养所得的植株体细胞含两个染色体组。
3．如图为小白鼠的胚胎干细胞分化示意图。
请回答：
（1）图中分化程度最低的是____________。
在体外培养条件下，培养液中加入________因子，可诱导胚胎干细胞向不同类型的组织细胞分化。
科学家将小鼠已分化体细胞的细胞核移入卵母细胞的细胞质中，培育出“克隆鼠”，这里用卵母细胞的原因是________________________________________________________________________。
直到今天也不能用类似________________（某种植物细胞工程的技术手段）的方法直接获得完整的动物个体。
因此，培育“克隆鼠”的过程，实际是通过________来实现的。
（2）在培育转基因鼠的过程中，人们将关键基因通过逆转录病毒转入小白鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞。
在该技术中，逆转录病毒是关键基因进入成纤维细胞的________，它能够携带外源基因进入受体细胞。
（3）在制取单克隆抗体过程中，用________细胞与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选最终得到能分泌________的杂交瘤细胞。
答案
（1）胚胎干细胞 分化诱导 卵母细胞可以给它提供表达全能性的环境 植物组织培养 （动物体细胞）核移植
（2）载体 （3）效应B淋巴（浆） 特异性抗体
解析
（1）图中分化程度最低的是胚胎干细胞。
在体外培养条件下，培养液中加入分化诱导因子，可诱导胚胎干细胞向不同类型的组织细胞分化。
科学家将小鼠已分化体细胞的细胞核移入卵母细胞的细胞质中，培育出“克隆鼠”，这里用卵母细胞的原因是：
卵母细胞可以给它提供表达全能性的环境。
直到今天也不能用类似植物组织培养（某种植物细胞工程的技术手段）的方法直接获得完整的动物个体。
因此，培育“克隆鼠”的过程，实际是通过（动物体细胞）核移植来实现的。
（2）在培育转基因鼠的过程中，人们将关键基因通过逆转录病毒转入小白鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞。
在该技术中，逆转录病毒是关键基因进入成纤维细胞的载体，它能够携带外源基因进入受体细胞。
（3）在制取单克隆抗体过程中，用效应B淋巴细胞（浆细胞）与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选最终得到能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
4．某研究者用抗原（A）分别免疫3只同种小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价（能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数），结果如图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞（染色体数目为40条），并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（染色体数目为60条）按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。
回答下列问题：
（1）制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。
达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是_______________________。
（2）细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有__________________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是______________________________。
（3）杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。
（4）未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是____________________。
答案
（1）4 Y Y小鼠的血清抗体效价最高
（2）B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% （3）1 100 （4）不能无限增殖
解析
（1）据图分析可知，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价几乎都达到16000以上，小鼠Y的血清抗体的效价最高，最适合用于制备单克隆抗体。
（2）融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞的自身融合细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞。
细胞的融合是随机的，并且不可能所有细胞都融合，故体系中会出现多种类型的细胞。
（3）动物细胞融合后形成的是具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
杂交瘤细胞的细胞核中的染色体数目最多为40＋60＝100（条）。
（4）正常细胞的分裂次数是有限的，且经过免疫的B淋巴细胞高度分化，不能无限增殖，而是经多次传代培养后逐渐衰老死亡。
5．科学家从某无限增殖的细胞中分离出无限增殖调控基因（prG），该基因能激发细胞分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更为广阔的前景。
请回答下列问题：
（1）利用________________________技术制备单克隆抗体，常用聚乙二醇、________________、电激等诱导因素诱导细胞融合。
再经多次筛选和细胞培养获得足够数量的能分泌所需抗体的________________细胞。
（2）有人提出用核移植技术构建重组细胞来生产单克隆抗体，请完成设计方案：
①取________________细胞的细胞核，移植到去核的能够________的细胞中，构成重组细胞。
（假定移植后细胞核中基因的表达状态不受影响）
②将重组细胞在________条件下做大规模培养或注射到小鼠________内增殖，以获得大量单克隆抗体。
（3）也有人提出，可以直接通过基因工程导入该调控基因（prG）来制备单克隆抗体，其思路如图所示。
①酶A是指______________，酶B是指____________。
②图中Ⅰ表示________________，对Ⅱ进行检测与鉴定的目的是__________，Ⅲ具有的特点是__________________________。
答案
（1）动物细胞融合 灭活的病毒 杂交瘤
（2）①特定抗原刺激的B淋巴 无限增殖 ②体外 腹腔 （3）①限制性核酸内切酶 DNA连接酶 ②目的基因（无限增殖调控基因或prG） 检测目的基因是否导入和是否表达 既能无限增殖，又能产生特定抗体
解析
（1）在利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程中，常用聚乙二醇、灭活的病毒、电激等方法诱导细胞融合，融合后的细胞经多次筛选和细胞培养，最终获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
（2）产生单克隆抗体的细胞应具有两个特点：
能无限增殖和产生特定抗体。
若用核移植技术构建重组细胞首先取特定抗原刺激的B淋巴细胞的细胞核，移植到去核的能够无限增殖的细胞中，构成重组细胞；然后将重组细胞进行动物细胞培养或注射到小鼠腹腔内增殖，以获得大量单克隆抗体。
（3）基因工程中第一步获取目的基因；第二步用限制性核酸内切酶和DNA连接酶处理供体DNA和质粒，获取基因表达载体（重组质粒）；第三步将重组质粒导入受体细胞；第四步检测目的基因是否导入和表达。
6．我国科学家张道远先生通过从耐旱灌木白花柽柳中克隆得到TSOD基因，利用转基因技术转化到棉花中，获得了具备更强抗旱性的T4代转基因棉花株系。
下图为转基因抗旱棉花的培育过程示意图，请据图回答：
（1）①过程表示用________扩增目的基因的方法。
②过程用到的工具酶有____________________。
步骤③一般用________处理农杆菌，使其易吸收周围环境中的DNA分子。
（2）将重组质粒导入棉花细胞除步骤④所示的方法外，还可采用________________。
如果受体细胞是动物的受精卵，则一般采用的方法是____________。
（3）外植体培养成为试管苗的过程采用了____________技术，利用了____________________的原理，步骤⑤⑥表示____
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